材料和试剂

新鲜或冷冻的肿瘤组织贮存在-80℃下
提取缓冲液（Life Technologies，目录号：FNN0011）
消泡剂Y-30乳液（Sigma-Aldrich，目录号：A5758）
BCA蛋白定量试剂盒（Interchim，目录号：MP2920）
ELISA试剂盒（Peprotech或R& D系统）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P-7949）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A-7030）
抗生物素蛋白-HRP偶联物溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A-7419）
10x Dulbecco's PBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：14200-075）
ABTS液体底物溶液（Sigma-Aldrich，目录号：A3219）

设备

均化器如Precellys（Ozyme BER1011S，France）或ultraturax
离心机
96孔板（DUTSCHER SCIENTIFIC，目录号：047632）
ELISA微孔板（Nunc MaxiSorp，目录号：439454）
Luminoskan（Thermo Fisher Scientific，目录号：5210470）

程序

将20mg新鲜或冷冻的肿瘤组织重悬于4℃的200μl提取缓冲液中
使用均化器如ultraturax或Precellys对组织进行机械研磨。使用ultraturax，使用如制造商描述的消泡溶液（Sigma-Aldrich-消泡剂Y-30乳液）。
将匀浆在4℃下以6,000rpm离心10分钟
回收上清液。 10μl上清液用于使用蛋白质测定法如BCA测定蛋白质浓度。样品可以储存在-80℃
细胞因子的测量必须如ELISA试剂盒制造商所述进行。
用PBS稀释捕获抗体至浓度为1μg/ml，并向每个ELISA板中加入100μl。密封板并在室温下孵育过夜
通过加入300μl洗涤溶液（1×PBS-0.05％tween-20）反转板以除去捕获抗体并在纸巾和洗涤板上印迹3次。倒置板，以除去洗涤溶液，并在纸巾上吸干
通过加入300μl/孔的1％BSA的1％PBS封闭平板。在室温下孵育1小时。
按照步骤7所述，颠倒板以去除封闭缓冲液并洗涤板3次。
使用2倍系列稀释的标准品在提取稀释液（1×PBS-0.05％Tween-20 - 0.1％BSA）中达到8点标准曲线，推荐使用高标准的2,000μg/
每孔加入100μl标准品或样品一式三份。在室温下孵育至少2小时。
按照步骤7所述，翻转平板以取出样品，并按标准和洗板重复3次。
稀释生物素化的检测抗体稀释液（1×PBS - 0.05％吐温-20 - 0.1％BSA）至500 ng/ml的浓度，每孔加入100μl。在室温下孵育2小时
按照步骤7所述，颠倒平板以去除检测抗体并洗涤板3次。
在稀释液（1×PBS-0.05％吐温-20-0.1％BSA）中以1:2000稀释的亲和素-HRP缀合物加入100μl/孔。在室温下孵育30分钟。
按照步骤7中所述颠倒平板以去除抗生物素蛋白-HRP缀合物和洗板3次
向每个孔中加入100μlABTS液体底物。在室温下孵育10分钟，用于显色
使用设置为405nm的酶标仪测定每孔的光密度。
平均每个标准，对照和样品的三次读数，并减去平均零标准光密度
通过绘制y轴上每个标准物的平均吸光度与x轴上的浓度并绘制通过图上的点的曲线来创建标准曲线。

致谢

我们的方案改编自以下文章：Grepin等人（2012）。我们感谢Brahimi-Horn博士提供编辑协助。财务支持：来自国家癌症研究所（INCA），法国癌症研究协会（ARC），法国基金会，"法国海滨旅游局"，罗氏法国的合同VEGFIL和" Tumurs du Rein（ARTuR）"。

参考文献

Greene，R.，Guyot，M.，Jacquin，M.，Durivault，J.，Chamorey，E.，Sudaka，A.，Serdjebi，C.，Lacarelle，B.，Scoazec，JY，Negrier，，H.和Pages，G。（2012）。在贝伐珠单抗/阿瓦斯丁治疗后小鼠中透明细胞肾细胞癌生长的加速：CXCL细胞因子的作用 Oncogene 31（13）：1683-1694。