材料和试剂

移液枪头（VWR）
24孔板（Corning，Costar ®，目录号：3524）
96孔板（康宁，目录号：3595）
加载移液器吸头
细胞培养瓶（康宁，目录号：430639）
96孔OptiPlate（PerkinElmer，目录号：6005290）
HTL细胞（来自G Barnea和R Axel，布朗大学和哥伦比亚大学的一份礼物）
Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：11965092）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：26140079）
胰蛋白酶0.25％-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：31985062）
X-tremeGENE 9试剂（Roche Diagnostics，目录号：06365787001）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Fisher Scientific，目录号：S374-1）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（EMD Millipore，目录号：PX1565-1）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：SX0420-5）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：BP366-500）
双荧光素酶报告基因检测试剂盒（普洛麦格，目录号：E1960）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS缓冲液）（见食谱）
1x被动裂解缓冲液（PLB）（见食谱）
LAR2底物（见食谱）
停止＆amp; Glo ®试剂（见食谱）

设备

微量移液器（Eppendorf）
Eppendorf®Research™Pro电子单道移液器（20-1,000μl）
37℃，5％CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma TM Series 3110水套）
细胞培养显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse TS100）
摇床（ARMA LAB，型号：轨道摇床100）
生物安全柜（贝克，型号：SterilGARD e3）
EnVision Multilabel Plate阅读器（PerkinElmer，型号：EnVision Multilabel）

软件

GraphPad Prism 5（ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）

程序

细胞培养
1. 在补充有10％（v / v）FBS的DMEM中，在37℃，潮湿的5％CO 2气氛下至约80％汇合培养HTL细胞。
2. 用0.25％胰蛋白酶-EDTA在37℃处理细胞约2分钟。用DMEM培养基（补充有10％（v / v）胎牛血清）将细胞稀释至0.4×10 6 / ml，并在1天前以每孔50,000个分裂到24孔板中转染。
转染
1. 准备一个样本的主混合：
  向无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：
  10μlOpti-MEM培养基
  0.195μlX-tremeGENE 9转染试剂。
  注意：
  1. 避免在添加试剂时触摸试管的一侧。
  2. 做大量样品的主混合物：例如，对于10个样品，乘以11来准备一些额外的混合物。（10×11 =110μl培养基+ 0.195×11 =2.145μlX-tremeGENE 9转染试剂）。
2. 每孔加入10μlOpti-MEM培养基到96孔板中，然后每孔加入65 ng总DNA。
  注意：我们通常将DNA质粒稀释到100 ng /μl的浓度，并将它们保存在4°C。
3. 每孔加入10μlMaster Mix至DNA混合物，轻轻混匀
4. 在室温下孵育约30分钟
5. 小心转移20μL混合物移液到24孔板培养细胞的每个井中。
  注意：在这个特例中，为了与γ-分泌酶共表达，转染20ng底物编码DNA，5ng phRG-tk Renilla标准化标准品和10ng每种γ-分泌酶亚基表达质粒。对于仅底物对照，转染20ng底物，5ng phRG-tk海肾和40ng pBSK模拟质粒。作为阳性对照，将10ng Rho（4M）-TEV-site-rTA，10ng Arr（3A）-TEV，5ng phRG-tk Renilla和40ng pBSK模拟质粒共转染（Kang等，2015 ）。
6. 将培养细胞在补充有10％（v / v）胎牛血清的DMEM中在37℃，5％CO 2的潮湿空气中培养。
萤光素酶测量
1. 培养一天后，使用加样枪头，通过真空泵从培养细胞中取出培养基，轻轻地加入足够量的PBS（500μl/孔）PBS（见食谱）冲洗每口井的底部。
2. 将100μl的1x PLB（参见食谱）分配到每个孔中，并轻轻地将培养板在室温下摇动15分钟（，例如<70rpm）。
  注意：我们使用Eppendorf研究 Pro电子单通道移液器（20-1,000μl）分配PLB缓冲液。但是，任何可以达到100μl的实验室移液器都应该没问题。
3. 将20μl无细胞碎片的PLB裂解液转移到96孔OptiPlate的每个孔中。
  注意：一般来说，在进行测定之前不需要清除残余细胞碎片的裂解物。
4. 对EnVision Multilabel Plate Reader进行编程，以执行2秒的预先测量延迟，然后使用96板美国发光孔径（700 nm发射滤光片）进行10秒的测量，用于每个记者测定。
5. 分配50μLLAR2底物（见食谱），通过移液2次或3次混合，并使用EnVision Multilabel Plate Reader来测量萤火虫萤光素酶活性。发光读取代表萤火虫萤光素酶活性。
6. 分配50μl新鲜制备的Stop＆amp; Glo试剂（参见配方）放在同一平板上，用移液器混匀2或3次，用EnVision Multilabel Plate Reader测量海肾荧光素酶活性。发光读取代表海肾荧光素酶活性。
7. 注意：将WT活动的相对活动标准化为100。

数据分析

每个实验至少进行三次（表1），计算的活动如表2所示。数据以分组条形图类型呈现。数据的统计分析可以用GraphPad Prism使用双尾Student's测试与对照（图2）完成。最近在（Yan等人，2017a和2017b）中显示了当前γ-分泌酶Epsilon-裂解测定的实际例子。

表1.原始的萤火虫和海肾活动读

表2.相对活动和正常化活动

注意：对于活动标准化，每个相对活动除以WT（C99-T4L-rTA）的相对活动的平均值和100倍。

图2.使用C99-T4L-rTA的相对报道基因活性误差棒= SEM，n = 3，P-value（双尾学生 / em> -test）：* P ＆lt; 0.05; ** P 0.01; *** P ＆lt; 0.001）。

笔记

细胞的状态是非常重要的。进行数据分析时，注意海肾荧光素酶信号（表3）。它应该是大约100万张照片。

表3.不良细胞状态示例

ctrl1组的3个孔和ctrl2组的3个孔应为阴性对照，低Renilla活性，这在一定程度上反映了细胞状态和转染效率，使得相对活性远高于正常水平。

食谱

10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS缓冲液）（1升）
11.5克Na 2 HPO 4 4 2克KH 2 PO 4 4克/克 80克NaCl
2克KCl
溶于1升无菌去离子水中 1x PBS的pH应该是7.4
1x被动裂解缓冲液（PLB）
从双荧光素酶报告基因检测试剂盒中加入1倍体积的5x PLB到4倍体积的蒸馏水中并充分混合

1x PLB可以储存在4°C以下，不超过一个月
LAR2底物（来自双荧光素酶报告基因检测试剂盒）
在萤光素酶测定缓冲液2（每瓶10ml）中重悬冻干的荧光素酶测定底物，-20°C保存少于1个月或-70°C少于1年。
停止＆amp; Glo试剂（来自双荧光素酶报告基因检测试剂盒）
添加1个音量停止＆amp; Glo ® Substrate to 49 volume Stop＆amp; Glo ®缓冲液和涡旋10秒

致谢

国家自然科学基金面上项目（31300607,31300245和91217311），科技部2012ZX09301001,2012CB910403,2013CB910600，XDB08020303,2013ZX09507001，上海市科委（13ZR1447600），国家自然科学基金），上海新星计划（14QA1404300），国家卫生研究院赠款DK071662（HEX），GM102545和GM104212（KM）。作者宣称没有利益冲突。

参考

Barnea，G.，Strapps，W.，Herrada，G.，Berman，Y.，Ong，J.，Kloss，B.，Axel，R.and Lee，K.F。（2008）。信号级联的遗传设计来记录受体激活。 Proc the Natl美国科学院院士105（1）：64-69
Kang，Y.，Zhou，XE，Gao，X.，He，Y.，Liu，W.，Ishchenko，A.，Barty，A.，White，TA，Yefanov，O.，Han，GW，Xu，Q ，Wa Wa，PW，Ke，J.，Tan，MH，Zhang，C.，Moeller，A.，West，GM，Pascal，BD，Van Eps，N.，Caro，LN，Vishnivetskiy，SA，Lee， RJ，Suino-Powell，KM，Gu，X.，Pal，K.，Ma，J.，Zhi，X.，Boutet，S.，Williams，GJ，Messerschmidt，M.，Gati，C.，Zatsepin，NA ，Wang，D.，James，D.，Basu，S.，Roy-Chowdhury，S.，Conrad，CE，Coe，J.，Liu，H.，Lisova，S.，Kupitz，C.，Grotjohann，I Fromme，R.，Jiang，Y.，Tan，M.，Yang，H.，Li，J.，Wang，M.，Zheng，Z.，Li，D.，Howe，N.，Zhao，Y 。，Standfuss，J.，Diederichs，K.，Dong，Y.，Potter，CS，Carragher，B.，Caffrey，M.，Jiang，H.，Chapman，HN，Spence，JC，Fromme，P.，Weierstall （Ernst，OP，Katritch，V.，Gurevich，VV，Griffin，PR，Hubbell，WL，Stevens，RC，Cherezov，V.，Melcher，K.和Xu，HE（2015））。用飞秒X射线激光结合视紫红质的视紫红质晶体结构自然 523（7562）：561-567。
Xu，T.H.，Yan，Y.，Kang，Y.，Jiang，Y.，Melcher，K。和Xu，H.E。（2016）。阿尔茨海默氏病相关突变增加淀粉样蛋白前体蛋白对γ-分泌酶切割的抗性，而Aβ42/Aβ40比率。 Cell Discov 2：16026.
Yan，Y.，Xu，T.H.，Harikumar，K.G.，Miller，L.J.，Melcher，K。和Xu，H.E。（2017a）。淀粉样蛋白前体蛋白的跨膜结构域的二聚化由γ-分泌酶切割位点周围的残基决定。 J Biol Chem 。
Yan，Y.，Xu，T. H.，Melcher，K.和Xu，H. E.（2017b）。定义γ-分泌酶的最小底物和电荷识别模型学术报告Pharmacol Sin 。