材料和试剂

移液器吸头（USA Scientific，目录号：1111-1700）
100毫米组织培养级塑料板（SARSTEDT，目录号：83.3902）
5ml组织培养管（Corning，Falcon，产品目录号：352052）
细胞培养瓶（康宁，目录号：3056）
96孔OptiPlates（PerkinElmer，目录号：6005290）
15ml锥形管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，产品目录号：339650）。
巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20B）
具有聚醚砜（PES）膜的快速流动瓶顶过滤器单元（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，目录号：595-3320）
PS1 / PS2删除的HTL单元
注意：该细胞系由Xu等人，2016利用CRISPR / Cas9从HTL细胞中删除PS1 / PS2得到，代表来自Barnea和Axel的来自HEK293细胞的细胞系，其稳定地整合了萤光素酶报道基因细菌操作元件tetO的控制。在这种情况下使用这些细胞来与需要特化细胞类型的特定功能测定相关联。在一般的协议中，任何转染的细胞类型都是可以的。
Dulbecco改良的Eagle's中等粉末（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，产品目录号：12100-038）（参见配方6，用于培养基制备）
胎牛血清II补充物，牛血清产品（GE Healthcare，Hyclone TM，目录号：SH30066.03）
用1×Dulbecco's磷酸缓冲盐溶液（pH6.8）稀释至0.05％的胰蛋白酶0.25％-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：25200056）
DEAE-葡聚糖盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：D9885）
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Biotech，目录号：BP231-1）
氯喹二磷酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：C6628）
无酶细胞解离液（EMD Millipore，目录编号：S-014-C）
磷酸二氢钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S0876）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：P285）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S671-500）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
HEPES（Research Products International，目录号：H75030-1000）
硫酸镁七水合物（MgSO 4•7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：M1880）
氯化钙二水合物（CaCl 2•2H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：C79-500）
氢氧化钠（NaOH）（VWR，目录号：BDH7247-1）
Coelenterazine-h（AAT Bioquest，目录号：21165）（见配方5制备原液）
甲醇（Honeywell International，目录号：24229）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM，目录号：15140122）
碳酸氢钠（Fisher Scientific，目录号：BP328-500）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A144-212）
10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS缓冲液）（见食谱）
10倍Kreb's-Ringers-HEPES储备液（10倍KRH）（见食谱）
50x CaCl 2储备液（见食谱）
1x KRH工作解决方案（请参阅食谱）
Coelenterazine-h溶液（见食谱）
1x DMEM组织培养基（见食谱）

设备

37℃，5％CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Forma TM Series 3110水套）
细胞培养显微镜（Fisher Scientific）
Micropipettes（吉尔森）
2103 EnVision Plate Reader（PerkinElmer，型号：2103 EnVision TM）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM，型号：Sorvall TM Legend TM XT / XF离心机，目录号：75216362） >
500毫升螺帽蒸压玻璃瓶（WHEATON，目录号：219759）

软件

GraphPad Prism 6（GraphPad Software，Inc.USA）

程序

细胞培养
1. PS1 / PS2缺陷的HTL细胞通常在补充有10％（v / v）胎儿克隆II和包括1x青霉素 - 链霉素（参见配方）的DMEM培养基中在37℃和潮湿的5％CO 2气氛。
2. 在37℃的培养箱中用0.05％胰蛋白酶-EDTA处理细胞5分钟以提起细胞。用培养基清洗细胞，并在转染前一天对它们进行计数以使得每100mm培养皿的电镀密度为1.5×10 6个细胞。
3. 在准备转染时，使用具有相位光学元件的细胞培养显微镜观察细胞汇合和它们的健康。
转染
1. 向无菌的5ml组织培养管中加入1.5ml无血清的DMEM培养基。
2. 加入75μlDEAE-葡聚糖溶液并充分混合。
3. 加入1.0μg总DNA（0.5μg供体+0.5μg使用标准DNA分离技术制备的受体）并充分混合。
4. 使用微量移液器将1.575μl的DNA-DEAE-葡聚糖复合物转移到每个平板上。
5. 在组织培养箱中37°C孵育2小时，不摇动。
6. 从每个平板吸取培养基，加入4毫升含有10％DMSO的DMEM，室温孵育2分钟，不摇动。
7. 从每个平板上吸取培养基，加入4毫升含有0.1μM氯喹的DMEM，37℃孵育2小时，不摇动。
8. 从每个平板吸取培养基，并加入8毫升含血清的完整DMEM培养基（见食谱）。
9. 将培养箱中的细胞在含有5％CO 2的潮湿气氛中于37℃孵育48小时。
发光和荧光测量
1. 转染48小时后，使用连接到真空源的巴斯德吸管从培养细胞中除去培养基，并轻轻地向每个板中加入5ml PBS（参见食谱）以冲洗细胞。
2. 将1ml无酶的细胞解离溶液分配到每个平板中，并在37℃下在组织培养箱中振荡孵育5分钟以释放细胞。
3. 将细胞转移到15ml锥形管中，并在室温下以175gxg离心细胞5分钟。
4. 在约1ml pH7.4的Kreb's-Ringer-HEPES培养基（参见食谱）中重悬细胞沉淀，以达到0.20×10 6个细胞/ ml的密度。保持这个管在室温下准备测定。
5. 将100μl细胞悬浮液（大约20,000个细胞）分配到白色96孔OptiPlate中，加入5μl腔肠素h（参见食谱），通过旋转板混合细胞，并且使用测量法测量发光信号和YFP荧光信号使用BRET模块的Envision Plate Reader。
6. 应当在添加腔肠素溶液之后立即收集发光和荧光信号。荧光分光光度计仪器应设置为选择特定的供体和受体对。在这里，对于所提出的BRET研究，应使用专用滤光片组（460nm，具有25nm的带宽）收集发光发射，并应使用专用滤光片组（535nm，带宽25nm）同时收集荧光发射。测量时间是0.2秒，测量高度是6.5mm。（Harikumar et al。，2007）。在该实例中，通过在475nm（带宽25nm）激发样品测量YFP荧光，并且在535nm（带宽25nm）收集发射，检测器增益150和闪光次数为20次。
7. 数据收集和分析的代表性例子如下：
  
  计算的BRET比率：1.23 - 0.70 = 0.53

数据分析

应至少在三个独立的实验中收集数据至少重复的条件。数据的统计分析可以用GraphPad Prism 6完成，使用Mann-Whitney后期检验进行检验。

笔记

控制供体和受体的表达水平对于消除旁观者的能量转移是重要的。在生理上存在的表达水平应该观察到显着的BRET信号。另外，BRET信号的饱和性和特异性是重要的，并且可以使用竞争性的未标记的感兴趣的蛋白质来建立。对于阳性对照，使用编码含有萤光素酶和黄色荧光蛋白（Rlu-YFP）的融合蛋白的构建体转染细胞，并测量BRET信号。

食谱

10x磷酸盐缓冲液（10x PBS缓冲液）（1 L）
11.5克Na 2 HPO 4 4 2克KH 2 PO 4 4克/克 80克NaCl
2克KCl
溶于1升无菌去离子水中调整1x PBS的pH值至7.4
在4°C储存
10x Kreb's Ringer- HEPES储备液（10x KRH）（1L）
59.58克HEPES
60.74克NaCl
3.72克KCl
1.36克KH 2 PO 4 4 2.96g MgSO 4 将组分溶解在去离子水中，使体积达到1L，不要调节pH值在4°C储存
50x CaCl 2储备溶液（100mM）（100ml）
1.47克CaCl 2 2 /
用去离子水定容至100 ml;不要调整pH值
在4°C储存
1x KRH工作解决方案（100毫升）
10毫升10倍KRH储备液
2ml 50x CaCl 2储备液
用去离子水定容至100 ml;用NaOH调节pH值至7.4
Coelenterazine-h溶液
0.5毫克coelenterazine-h粉

溶于12.5毫升5％甲醇/ 95％水中在-20°C储存
1x DMEM组织培养基（1L）
1. 向1L去离子水中加入1L Dulbecco改良Eagle培养基（13.4g）和3.7g碳酸氢钠。
2. 用HCl调节pH至6.90，使用含有聚醚砜（PES）膜的0.2μm快速流动瓶顶过滤器单元过滤到500ml螺旋盖高压灭菌的玻璃瓶中。
3. 在4°C储存

致谢

这项工作由Mayo Clinic（LJM），Van Andel研究所，国家自然科学基金（31300607,31300245和91217311），科技部2012ZX09301001,2012CB910403和2013CB910600，XDB08020303,2013ZX09507001，上海科学技术委员会（13ZR1447600），上海新星计划（14QA1404300）和国家卫生研究院拨款DK071662（HEX），GM102545和GM104212（KM）。作者没有利益冲突或利益冲突。

参考

Dacres，H.，Wang，J.，Dumancic，M.M。和Trowell（2010）。两种常用生物发光共振能量转移对的实验确定Förster距离 < em> Anal Chem 82：432-435。
Harikumar，K.G.，Pinon，D.I。和Miller，L.J。（2007）。跨膜片段IV为II类G蛋白偶联分泌素受体的寡聚化提供了一个功能重要的界面。 J Biol Chem 282：30363-30372。
Xu，T.H.，Yan，Y.，Kang，Y.，Jiang，Y.，Melcher，K。和Xu，H.E。（2016）。阿尔茨海默氏病相关突变增加淀粉样蛋白前体蛋白对γ-分泌酶切割的抗性，而Aβ42/Aβ40比率。 Cell Discov 2：16026.