材料和试剂

移液器吸头，10μl（海门塑料，20111088）
移液器吸头，200μl（Corning，Axygen ®，目录号：T-200-Y-R）
移液器吸头，1毫升（海门塑料，20111011）
细胞培养板（100mm）（Corning，目录号：430167）
细胞培养板（60mm）（Thermo Fisher Scientific，目录号：150288）
15毫升管（Thermo Fisher Scientific，目录号：339651）
70μm细胞过滤器（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：22-363-548）
细胞培养板（6孔）（Corning，目录号：3516）
细胞培养板（24孔）（Corning，目录号：3524）
细胞成像板，24孔，玻璃底（Eppendorf，目录号：0030741021）
尼龙膜（罗氏诊断，目录号：11417240001）
人肝癌HepG2细胞（原来自中国武汉中国典型培养物保藏中心）
最低必需培养基（MEM，粉末）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：41500-083）
胎牛血清，Qualified，Australia Origin（赛默飞世尔科技，目录号：10099141）
X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent（罗氏诊断，目录号：06366236001）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：31985070）
0.25％胰蛋白酶-EDTA（1x），酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：25200-114）
嘌呤霉素（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：A1113803）
小鼠抗-HBcAg（Innodx Biotechnology，目录号：2A7-21 [它是新的抗HBc单克隆抗体，可根据要求提供]）
Alexa Fluor ® 488驴抗小鼠IgG（H + L）（赛默飞世尔科技，目录号：A-21202）
DAPI（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：D1306）
Micrococcal nuclease（Takara Bio，目录号：D2910）
蛋白酶K（Takara Bio，目录号：D9033）
乙醇，C 2 H 6 O，AR（Xilong Scientific，目录号：1030029AR）
寡核苷酸
dNTP Mixture2.5μM（Takara Bio，目录号：D4030A）
DIG Easy Hyb颗粒（罗氏诊断，目录号：11796895001）
PrimeSTAR GXL DNA聚合酶（Takara Bio，目录号：DR050A）
Premix Ex Taq TM （探针qPCR）（Takara Bio，目录号：RR390A）
酪蛋白10x封闭缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：B6429-500ML）
抗DIG（AP）抗体（Roche Diagnostics，目录号：11093274910）
CDP-Star AP底物（Roche Diagnostics，目录号：12041677001）
通用DNA纯化试剂盒（TIANGEN Biotech，目录号：DP214-03）
乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒（CLEIA）（万泰生物制药，目录号：HBV-1396）
乙型肝炎e抗原诊断试剂盒（ELISA）（万泰生物制药，目录号：HBV-0396）
ED-11（Innovax Biotechnology）
病毒DNA / RNA提取试剂盒（GenMag Biotechnology，目录号：NA007）
无支原体的新生牛血清（天行生物技术，目录号：11011-8615）
氯化钠（NaCl，AR）（Xilong Scientific，目录号：1001012AR）
氯化钾（KCl，细胞培养物）（Sigma-Aldrich，目录号：P5405）
盐酸（HCl，AR）（Xilong Scientific，目录号：1029013AR）
氢氧化钠（NaOH，AR）（Xilong Scientific，目录号：1001037AR）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ·12H 2 O，AR）（Xilong Scientific，目录号：1001067AR）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ，AR）（Xilong Scientific，目录号：1002048AR500）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ，AR）（Xilong Scientific，目录号：44558）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：16005-1KG-R）
Triton X-100（AMRESCO，目录号：0694）
牛白蛋白（低内毒素）（ICPbio International，目录号：ABRE-1KG）
Tris base（SEEBIO BIOTECH，目录号：183995）
三饱和苯酚（Solarbio，目录号：T0250）
乙二胺四乙酸（EDTA，AR）（Xilong Scientific）
NONIDET ® P-40替代品（AMRESCO，目录号：M158-500ML）
氯化钙（CaCl 2 ，AR）（Xilong Scientific，目录号：U1000566-500g）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Merck，目录号：428015）
氯仿（AR）（Xilong Scientific，目录号：1039013AR500）
异戊醇（AR）（西龙科学，目录号：U1001975-500ml）
马来酸（Sigma-Aldrich，目录号：M0375）
Tween-20（BBI Solutions，目录号：TB0560-500ml）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA-Na 2 ·2H 2 O，AR）（Xilong Scientific，目录号：100186）
乙酸盐（CH 3 COOH，AR）（Xilong Scientific，目录号：1029047AR）
柠檬酸钠（C 6 H 5 Na 3 O 7 ，AR）（Xilong Scientific，目录号：1001059AR ）
Verson缓冲区（见食谱）
PBS缓冲液（见食谱）
4％多聚甲醛（见食谱）
0.2％Triton X-100（见食谱）
3％BSA（见食谱）
NET缓冲区（见食谱）
1.2 M CaCl 2 （见食谱）
0.5 M EDTA（见食谱）
10％SDS（见食谱）
苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）（见食谱）
马来酸缓冲液（见食谱）
洗涤缓冲液（见食谱）
检测缓冲液（见食谱）
50x TAE缓冲液（见食谱）
脱脓缓冲液（见食谱）
变性缓冲液（见食谱）
中和缓冲液（见食谱）
10x SSC（见食谱）
2x SSC / 0.1％SDS（见食谱）
0.5x SSC / 0.1％SDS（见食谱）

设备

移液器（Mettler-Toledo International，RAININ，型号：Pipet-Lite）
CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：3111）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Pico TM 17）
Sorvall制冷离心机（赛默飞世尔科技，型号：Sorvall TM ST 16R）
BD FACS Aria III（BD，型号：FACSAria TM III）
高内容筛选系统（PerkinElmer，型号：Opera Phenix TM ）
水浴（Grant Instruments，型号：GD100）
UV交联仪（上海西格玛高科技，型号：SH4）
Bio-Rad真空吸墨纸（Bio-Rad Laboratories，型号：Model 785）
多功能分子杂交烤箱（UVP，型号：HM-4000）
ImageQuant LAS4000 mini（GE Healthcare，型号：ImageQuant LAS 4000 mini）
塑料薄膜封口机（上海明威，型号：F-400）
Biomek NX P （Beckman Coulter，型号：Biomek NX P ）
微孔板阅读器（Autobio，型号：PHOmo）
猎户座II微孔板光度计（Titertek-Berthold，型号：猎户座II）
电泳仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：1645050）
LightCycler ® 96（Roche Molecular Systems，型号：LightCycler ® 96）

程序

产生HBV复制的稳定细胞系
1. 转染HepG2细胞
  1. 在37℃，CO 2 培养箱中在MEM / 10％FBS中培养HepG2细胞。在转染前24小时将细胞分裂成10-cm平板; DNA转染时细胞密度应达到70-90％。
  2. 分别用2ml opti-MEM无血清培养基稀释20μg基因型Ae（AY707087），Ba（GU357842），Ce（GU357845）和D1（GU357846）的pTSMP-HBV1.3质粒。轻轻混合。
    注意：本研究中使用的pTSMP-HBV1.3质粒图谱和HBV1.3基因组结构分别如图2A和2B所示。可以参考pTSMP-HBV1.3质粒的构建（Wu等，2016）。
  图2. pTsmP载体（A）和HBV 1.3基因组构建（B）的示意图
  1. 将X-tremeGENE HP DNA转染试剂（60μl）直接吸移到含有稀释DNA的培养基中，不要与塑料管壁接触。轻轻混合。
  2. 将转染试剂：DNA复合物在室温下孵育15分钟。
  3. 以逐滴的方式将转染复合物添加到细胞中。
  4. 转染后，将细胞在37℃，5％CO 2 培养箱中孵育48小时;具有活化红色荧光（mCherry阳性）的成功转染细胞可通过荧光显微镜观察并通过流式细胞术分选。
2. 流式细胞术分选成功转染的细胞
  1. 用5 ml Verson缓冲液清洗细胞（参见食谱）并弃去上清液。
  2. 向细胞中加入500μl0.25％胰蛋白酶-EDTA，在37℃下孵育3分钟。
  3. 加入5 ml MEM / 10％FBS以阻止消化。
  4. 将2×10 7 细胞转移到15ml管中。
  5. 离心细胞1,000 x g 3分钟，然后弃去上清液。
  6. 用5 ml PBS缓冲液清洗（参见食谱）。
  7. 将细胞以1,000 x g 离心3分钟，然后弃去上清液。
  8. 将细胞重悬于7 ml PBS缓冲液中，然后通过70μm细胞过滤器过滤。
  9. 在BD FACS Aria III机器上运行样品，所需的激发光为561nm（图3）。
  图3.第一轮mCherry激活的FACS分选。具有未表达的mCherry的阴性细胞是HepG2（蓝色峰），表达mCherry的阳性细胞是HepG2-pTsmp-1.3HBV-S11（红色峰）。
  1. 将分选的表达mCherry的细胞在6孔培养板中培养，在嘌呤霉素选择（2μg/ ml）存在下进行扩增。每2天刷新含有嘌呤霉素的培养基。
  2. 第二天，当细胞汇合度为70-80％时，将细胞进行第二轮mCherry荧光激活FACS分选并进一步选择嘌呤霉素。
  3. 在大约4轮mCherry荧光激活FACS分选和嘌呤霉素抗性细胞选择后，超过90％的细胞是嘌呤霉素抗性并且稳定表达mCherry。
  4. 这些细胞进一步繁殖。传代10次后，4种HBV细胞系中几乎100％的细胞持续表达mCherry并在嘌呤霉素存在下生长良好。

HBV复制稳定细胞系的表征

乙型肝炎病毒核心抗体的免疫荧光
1. 细胞制备
  在细胞成像板上种子4×10 5个 5 pTSMP-HBV1.3细胞和3.5×10 5个 5 亲本HepG2细胞（用作阴性对照），密度为70 ％。将细胞在37°C和5％CO 2 的培养箱中孵育24小时。
2. 细胞洗涤
  丢弃培养基，用500μlPBS洗一次。
3. 固定
  沿细胞板一侧每孔加入250μl4％甲醛（见食谱）。让细胞在室温（RT）下在黑暗中固定15分钟。用1 ml 1x PBS冲洗3次，每次3分钟。
4. 渗透性
  每孔在250μl0.2％Triton X-100（参见配方）中孵育样品5分钟。用1 ml 1x PBS冲洗3次，每次3分钟。
5. 封锁
  用PBS中的250μl3％BSA（参见食谱）孵育细胞1小时以阻断抗体的潜在非特异性结合，然后丢弃上清液。
6. 一抗将细胞与250μl抗HBcAg抗体（在3％BSA中1：1,000稀释）在室温下（或在4℃下过夜）在黑暗中孵育1小时。接下来，取出溶液，用1 ml /孔PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。
7. 二抗
  将细胞与250μl二抗（Alexa Fluor ® 488驴抗小鼠IgG（H + L），1：1,000稀释于3％BSA中）在室温下在黑暗中孵育30分钟。取出溶液，用1 ml /孔PBS洗涤3次，每次3分钟，黑暗。
8. 反击
  将细胞与250μlDAPI（在3％BSA中1：2,000稀释）在室温下在黑暗中孵育5分钟。弃去溶液，用1 ml /孔PBS洗涤3次，每次3分钟。
9. 照片
  照片在高内容筛选系统中（图4）。成像仪中使用的设置用于成像（表1）。
  
  表1.高内容筛选系统中用于成像的设置
图4. HBV细胞系HBcAg的免疫荧光（共焦模式，40x水镜片）

Southern印迹

细胞：在6cm培养皿中铺板4×10 6个细胞，具有60-70％汇合。培养细胞2天，然后进行下一个实验。
提取HBV总DNA
1. 弃去细胞上清液，用冷PBS洗涤2次。
2. 在细胞沉淀中加入600μlNET缓冲液（参见食谱），在冰上（或4°C）孵育1小时。
  注意：我们通常在6孔板的一个孔中加入200-300μl;或400-600μl一个6厘米的碟子;或10厘米培养皿中的1.2-1.8毫升。
3. 将裂解液在13,400 x g 中于4°C离心20分钟，并将上清液（600μl）转移到新的1.5 ml EP管中。
4. 加入2μl微球菌核酸酶（10 mg / ml）和3μl1.2M CaCl 2 （最终浓度为6 mM）（参见配方），在37°C水浴中孵育30分钟。 br />
5. 加入30μl0.5M EDTA（终浓度为25 mM）（参见配方），在65°C水浴中孵育15分钟。
6. 加入6.68μl蛋白酶K（19 mg / ml）和32.1μl10％SDS（参见食谱），在50°C水浴中孵育过夜（至少12 h但不超过18 h）（终浓度为200μg/ μl蛋白酶K和0.5％SDS）。
7. 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（约600μl），通过倒置管多次彻底混合，并在室温（15-25℃）下孵育5分钟。在14,000 x g 离心10分钟，并将水相转移到新的1.5 ml EP管中。
8. 重复上述步骤（步骤B2b）vii两次。
9. 通过加入两倍体积的无水乙醇和1/10体积的乙酸钠沉淀DNA，然后在-80℃下放置2小时。在4℃下以14,000 x g 离心10分钟。小心滗出上清液。
10. 用500μl75％乙醇洗涤DNA沉淀，并在14,000 x g 离心5分钟。小心滗出上清液。
11. 风干颗粒5-10分钟，并将DNA重新溶解在35μl蒸馏去离子水中。将HBV DNA保存在-80°C直至使用。

HBV探针的构建

根据以下组分制备PCR反应溶液：

5x PrimeSTAR GXL缓冲区	5μl
HBx-probe-F（10μM）	1μl
HBx-probe-R（10μM）	1μl
dNTP Mix（2.5μM）	2μl
DIG-dUTP	2μl
pGEM-1.3 HBV	1μl
PrimeSTAR GXL DNA聚合酶	1μl
ddH 2 O	37μl

PCR反应
使用Universal DNA Purification Kit纯化HBV探针。
评估探针的效果
1. 将探针稀释至2 ng /μl作为第一梯度，10倍稀释至总共5个梯度，最小浓度为0.2 pg /μl。
2. 通过移液管将稀释的探针放在一片尼龙膜上，每个5μl（最终负载：10,000 pg，1,000 pg，100 pg，10 pg，1 pg）。在每个点之间保持一定的距离，以避免污染。
3. 紫外线照射（1.5 J / cm 2 ）3分钟。
4. 用1x封闭缓冲液封闭30分钟（在马来酸缓冲液中稀释的酪蛋白封闭缓冲液[10x] [见食谱]）。
5. 用抗DIG（AP）抗体（在1x封闭缓冲液中1：3,000稀释）孵育40分钟。
6. 用洗涤缓冲液（参见食谱）洗涤尼龙膜3次，每次10分钟。
7. 用检测缓冲液（参见配方）冲洗2分钟。
8. 将AP底物添加到膜上以完全渗透它。
9. 使用ImageQuant LAS4000 mini进行曝光。需要实验探针的强度才能使2 pg /μl或以下的点可见，以产生令人满意的杂交结果。如果探测信号弱于此，则很难检测来自低丰度物种的信号（图5）。

Southern印迹分析
1. 将DNA样品通过1.2％琼脂糖凝胶在80 V电泳下在1x TAE缓冲液中分离2小时（参见食谱）。
2. 电泳完成后，如下处理凝胶（以下步骤在振荡器上操作）：
  
  1）
  将凝胶转移到托盘中并加入脱嘌呤缓冲液（参见食谱）以浸泡凝胶，在振荡器上在室温下孵育15分钟并轻轻摇动（将DNA分解成更小的片段，从而允许更有效地从凝胶转移到膜上）。
  
  2）
  去除脱嘌呤缓冲液。用ddH 2 O冲洗凝胶两次，每次1分钟。
  
  3）
  用变性缓冲液（参见食谱）冲洗两次，每次15分钟。
  
  4）
  用ddH 2 O冲洗凝胶两次，每次1分钟。
  
  5）
  用中和缓冲液（参见配方）冲洗10分钟。
3. 用真空吸墨纸将DNA从凝胶转移到尼龙膜上，用10x SSC处理1.5小时（图6）。
  注意：通过将膜以45度角缓慢降低至水中，在双蒸水中润湿预切尼龙膜。然后，用10x SSC润湿膜和滤纸;按图6所示的顺序放置凝胶和尼龙膜;去除凝胶和膜之间的气泡;启动真空源并慢慢地顺时针旋转放气阀，直到仪表读数为5英寸汞柱。

凝胶转移后，通过1.5 J / cm 2 的UV交联将DNA固定在尼龙膜上3分钟。
注：照射时间=照射剂量（mJ / cm 2 ）/照射强度（mW / cm 2 ），该仪器的照射强度为9.0 mW / cm 2 。
预杂交步骤
将膜置于含有10ml DIG Easy Hyb缓冲液的杂交塑料薄膜中，在42℃杂交室中温育2小时，温和搅拌。
杂交

1）
将DNA探针在95°C下变性5分钟，然后立即置于冰上2分钟。

2）
用300 ng DIG-dUTP标记的HBV探针替换预热的10 ml DIG Easy Hyb缓冲液，在42°C杂交室中温和搅拌过夜。
洗

1）
在室温下用2x SSC / 0.1％SDS缓冲液洗涤2次，每次5分钟。

2）
用预热的0.5x SSC / 0.1％SDS缓冲液在65°C下洗涤2次。
注意：使用前摇动缓冲区。
发现

1）
用马来酸缓冲液（见食谱）冲洗2分钟。

2）
用1x封闭缓冲液（用马来酸缓冲液稀释10倍封闭缓冲液）封闭30分钟。

3）
用抗DIG（AP）抗体（在1x封闭缓冲液中1：3,000稀释）孵育40分钟

4）
用100ml洗涤缓冲液洗涤3次，每次15分钟。
注意：洗涤缓冲液在使用前均匀摇匀。

5）
在20 ml检测缓冲液中平衡3 min。

6）
逐滴添加带有AP底物的膜，以便完全渗透。

7）
连续曝光膜并使用ImageQuant LAS4000 mini拍摄图像。

检测上清液中病毒标志物的水平
1. 细胞
  1. 在24孔板中种子3.5×10 5 pTSMP-HBV1.3细胞，密度为60-70％。
  2. 每2天补充并收集用于测量病毒抗原和HBV DNA的培养基。
  3. 在1个月内监测每种细胞系的上清液中这些病毒标记物的水平。
2. 病毒抗原
  1. 使用商业化验试剂盒（万泰，北京，中国）通过化学发光法测定培养基中的病毒抗原（HBsAg和HBeAg）。
  2. 抗原（HBsAg和HBeAg）标准品是标准化患者血清，原始浓度分别为90,000 IU / ml和10,000 Ncu / ml。
  3. HBeAg标准品用20％NBS稀释成六种梯度浓度，分别为10,5,2.5,1.25,0.25,0.05 Ncu / ml。
  4. 将HBsAg的标准品用ED-11稀释成六种梯度浓度，分别为45,9,1.8,0.36,0.072,0.0144IU / ml。
3. HBV总DNA
  1. HBV总DNA提取
    
    1）
    在Biomek NX P （Beckman，California，USA）上使用病毒DNA / RNA提取试剂盒提取培养基中的总DNA。
    
    2）
    HBV总DNA标准品是标准化患者血清，原始浓度为1.5×10×sup <8> IU / ml，用PBS稀释10倍稀释至6个梯度。
  2. 根据以下组分制备PCR反应溶液。
    
    2x Premix Ex Taq（探针qPCR）
    10μl
    
    KHF2（100μM）
    0.1μl
    
    KHR1（100μM）
    0.1μl
    
    KHP4（100μM）
    0.05μl
    
    DEPC水
    4.75μl
    
    模板
    5μl
  3. 用LightCycler 96进行实时PCR反应。