材料和试剂

PTFE管，内径0.8 mm，外径1.6 mm（Cole-Parmer仪器，产品目录号：EW-06407-41）
不锈钢导管连接器，20 ga x 15 mm，非无菌（Instech实验室，目录号：SC20 / 15）
CellTrics过滤器，50μm黄色（Sysmex，目录号：04-0042-2317）
1.5毫升微管（例如SARSTEDT，目录号：72.706.400）
Falcon 5毫升圆底管，一次性聚苯乙烯（Corning，Falcon ®，目录号：352054）
1.4毫升非编码螺旋盖管U型底部散装（Micronic，目录号：MP32062）
胶带
铝箔
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34120）
可选：用于液滴分析的显微镜载玻片（例如Kova Glasstic Slide 10 With Counting Grids，Kova International，目录号：87144E）
手套
小型可重复密封的塑料袋
2个SGE气体紧密注射器，固定鲁尔锁，体积100μl（Trajan Scientific，SGE Analytical Science，目录号：005229）
SGE Gas紧密注射器，固定鲁尔锁，容积5 ml（Trajan Scientific，SGE Analytical Science，目录号：008762）
Hamilton针20规格，Kel-F Hub NDL，2英寸，点式3（Hamilton，目录号：90520）
电子。含有待筛选文库的大肠杆菌（或其他细菌）细胞
冰
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M5904）
3M Novec 7500工程液（称为HFE-7500油）（3M，目录号：Novec 7500）
HFE7500中的5％（w / w）008-氟表面活性剂（Ran Biotechnologies，目录号：008-FluoroSurfactant-5wtH-20G）（避光）
超低凝胶温度琼脂糖，IX-A型（Sigma-Aldrich，目录号：A2576）
1H，1H，2H，2H-全氟-1-辛醇（PFO），97％（Sigma-Aldrich，目录号：370533）
培养皿（14厘米）（Thermo Fisher Scientific，Nunc TM ，目录号：249964）
玻璃珠（2毫米）（Sigma-Aldrich，目录号：Z273627）
注射器过滤器孔径0.22μm，直径25 mm（Corning，目录号：431219）
SYTO 9绿色荧光核酸染色（Thermo Fisher scientific，目录号：S34854）
硫酸铵（（NH 4 ）2SO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：09978）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：60356）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5379）
硫酸铁（II）七水合物（FeSO 4 ·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：215422）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：221473）
盐酸硫胺素（Sigma-Aldrich，目录号：T1270）
酪蛋白氨基酸（BD，Bacto TM ，目录号：223050）
硫酸镁（MgSO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：M2643）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S3264）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
胰蛋白胨（BD，Bacto TM ，目录号：211705）
酵母提取物（BD，Bacto TM ，目录号：212750）
硫酸卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K4000）
含有适当抗生素和诱导剂浓度的细菌培养基（在我们的例子中是M63培养基，参见食谱）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
LB培养基（见食谱）
LB-Agar平板含有适当的抗生素（见食谱）

设备

微流体装置产生油包水滴（直径20-50μm）
注意：例如，从Wunderlichips GmbH购买的PDMS设备（正如我们所做的那样。设备的设计由客户选择。如果您想购买我们设计的设备，请在联系Wunderlichips时参考本出版物。）。或者，可以如先前详细描述的那样制备装置，包括使它们疏水所需的表面改性（Devenish等，2013）。本研究中使用的设备的设计文件（40μm流聚焦通道）可从作者的网站 :(图1）。

图1.用于产生液滴的微流体装置的设计该装置包含油相入口，水相入口（细菌，琼脂糖，培养基）和出口。液滴在流动聚焦几何形状处形成（图片插图）。对于该协议，流聚焦部分处的沟道宽度为40μm，沟道的高度也为40μm。使用该装置，可以生产直径为40-50μm的液滴。比例尺=40μm。
注射泵（例如阿拉丁输液泵，World Precision Instruments，目录号：AL300-220）
倒置光学显微镜（例如Leica Microsystems，型号：Leica DM IL LED）（传统显微镜也是可能的，但微流体装置的管道可能会干扰光学器件。）
荧光激活细胞分选仪（例如BD，型号：FACSAria TM III）
高速摄像机（例如Teledyne DALSA，型号：Genie Nano M640 Mono，目录号：G3-GM10-M0640）
注意：标准相机的速度不足以观察/记录连续的液滴形成。但是，如果曝光时间可以调整到约50微秒，可以用单张照片监控液滴形成。
油管切割机（Cole-Parmer，目录号：EW-06438-10）
2热/冷压缩（来自药房或杂货店）
Lab jack（Bochem Instrumente，目录号：11020）
注意：或者使用正确高度的一些盒子将泵与水性注射器放在显微镜载物台的高度。
-80°C冰柜
4°C冰箱
一套覆盖0.5-1,000μl的移液器（例如来自Gilson）
钳子
镊子
剪刀
37°C培养箱
高压灭菌器
台式离心机用于1.5 ml管
分光光度计，nanodrop或读板仪测量细菌培养物的吸光度
用于1.5 ml管的热块

软件

用于控制高速摄像头的软件（例如Labview或Common vision blox，Stemmer成像）
图像处理程序，如ImageJ或Photoshop
用于控制FACS的软件（例如BD FACSDIVA）
流式细胞仪分析软件如FlowJo（LLC）

程序

准备液滴形成
1. 在实验前的晚上，通过将它们接种到含有适当抗生素（或另一种合适的培养基）的约5ml LB中，并在摇动中将它们在37℃下孵育12-18小时，制备待分选细胞的预培养物。孵化器。或者，该方案也可以从甘油储备（储存在-80℃）开始，例如，通过将420μl过夜培养物加入180μl50％制备的15％（v / v）甘油储液（v / v）甘油。
2. 将高速摄像头连接到倒置显微镜（通过C接口）。
3. 调整高速摄像机的设置。提供足够的光线，以便将曝光时间调整到最小（~50μsec）并将帧速率调到最大。缩小图像尺寸还可以提高帧速率。
  注意：为了很好地观察液滴形成，帧的频率应高于液滴形成的频率。我们通常以每秒≥600帧的速度工作。
4. 将注射泵放在靠近显微镜的位置。为了保持管道短路并避免管道中琼脂糖凝胶化，注射器与水溶液的泵应尽可能靠近显微镜载物台。我们使用实验室千斤顶将其放置在正确的高度（图2）。
  
  图2.用于产生微流体液滴的设备设置。 A.整个设置的概述。 B.显微镜载物台上的特写视图。
5. 调整泵的直径：5毫升注射器（油）为10.3毫米，100微升注射器（水相）为1.46毫米。
6. 用钳子弯曲三个钢制连接器，在其中心引入90°弯曲。
7. 将设备固定在显微镜载物台上。用10倍物镜检查设备，并专注于流量聚焦部分。
8. 切割三段管（最好用管道切割器）：分别用于进油口，水溶液入口和出口。入口管必须足够长，以便将注射器与设备连接起来。油的那个可能很长（在我们的情况下通常为40厘米）。用于水溶液的溶液应尽可能短，以避免管中琼脂糖的凝胶化。在我们的例子中，它是≤5厘米。确切的长度取决于您的显微镜设置。出口管约9厘米。
  注意：由于使用的质粒带有抗生素抗性基因，我们在没有无菌技术的情况下执行该方案。然而，高压灭菌管道和钢制耦合器，并用70％乙醇对注射器和设备进行消毒。
9. 用手将每根管子连接到弯曲的钢制连接器上（戴手套）。
10. 用手将出口管连接到设备上（戴手套）。
11. 用剪刀在1.5毫升微量离心管的盖子上做一个小孔。盖上盖子，将其放在另一个打开的微量离心管上。将出口管穿过小孔进入微量离心管，用于收集液滴。盖子上的孔可以防止出口管子掉出来。用胶带将管子固定在显微镜载物台上，然后用一个装满冰块的可重新密封的塑料袋冷却。
12. 通过将0.5-1ml的5％008-氟表面活性剂在HFE-7500中移液至4.5-9ml HFE-7500，制备5-10ml含0.5％008-氟表面活性剂的氟化油（HFE-7500）溶液。它可以在室温下保存几个月。用铝箔保护灯管不受光照。
13. 在5毫升注射器中注入油/表面活性剂。去除气泡。
14. 将油管连接到注射器的针头，并用油完全填充。确认油从钢制连接器中流出（进入Kimwipes纸巾）并且管道中没有留下气泡。
15. 用泵上的油固定5毫升注射器。
16. 将钢制连接器插入设备的进油口，将油管与油管连接。
17. 在您选择的培养基（我们的病例为M63）中制备1-2 ml 2％（w / v）琼脂糖，包括适当的抗生素。最简单的方法是将约20毫克琼脂糖称入微量离心管中，并加入适量的培养基（在20毫克的情况下为1毫升）。将琼脂糖在60°C的热块中孵育至少15分钟，使琼脂糖融化。
  注意：我没有使用高于60°C的温度来融化琼脂糖，以防止步骤A22中因温度升高导致细胞死亡。
18. 从新鲜的预培养物或甘油原液中获取细菌细胞。旋转它们（~3,000 x g ，5分钟）并重新悬浮在您将要在实验中使用的培养基中。
19. 用分光光度计，nanodrop或读板仪测量细胞在600nm处的吸光度。
20. 计算要添加的细胞数量，以获得所需的细胞负载量。这取决于液滴尺寸并遵循泊松分布（有关计算的逐步示例，请参阅注释）。
21. 在培养基中以计算的密度制备~500μl细胞。
22. 将100μl熔化的琼脂糖（2％（w / v））加入100μl细胞中，得到含有细胞和1％（w / v）琼脂糖的水溶液。
23. 从现在开始，您应该注意保持琼脂糖溶液温暖。快速工作以避免琼脂糖凝胶化，并使用预热（例如，在60°C培养箱中）热/冷压缩保持温度。
24. 用琼脂糖水溶液填充100μl注射器。尽量避免气泡。可能需要将液体排出并取出几次，直到没有气泡留下。
25. 将水溶液的管道连接到注射器。用水溶液完全填充管道。检查解决方案是否来自钢制连接器（进入Kimwipes纸巾）并且管道中没有留下气泡。
26. 将注射器固定在泵上。将预热（例如，在60°C培养箱中）热/冷压缩到注射器和管道上以避免琼脂糖凝胶化。
27. 将管道与水溶液连接到设备（通过钢制连接器）。
液滴形成和微菌落生长
1. 启动泵用于润滑油。使用大约2,000μl/ h直到您看到油进入设备（<5分钟）。
2. 启动泵用于水溶液。使用约150μl/ h直至看到液滴形成。然后将流速减慢到80μl/ h。等到液滴形成稳定（<5分钟）。
  注意：
  1. 这些是我们通常使用的流量。装置设计和水相的组成影响最佳流速。选择的流速会影响液滴尺寸和液滴形成的频率。
  2. 不稳定液滴形成的典型原因是：“喷射” - 水相超出装置的流动聚焦部分并形成不规则液滴（降低水流速），琼脂糖开始凝固成凝胶（保持注射器加热器），设备被一些灰尘堵塞，或者PDMS设备从通道或入口周围的玻璃滑块上脱落（更换设备）。
3. 拍摄设备中液滴的一些照片，以便确定它们的大小（参见注释1-2）。
4. 让设备运行，直到您生成任意数量的液滴。不时用温暖的热敷替换热/冷敷。确保注射器没有液体用完。
  注意：对于这些流速，我们通常具有大约340 Hz的频率，即，我们产生1.2 x 10 6 液滴/ H。其中百分之七十四不会包含任何细胞。在此过程中也会丢失一些珠子。
5. 如果您想要同一样品的多个等分试样（例如，以测试不同的孵育时间），在特定的时间后更换收集管更容易，更准确（例如
6. 如果您想制作第二个样品，请在第二个100μl注射器（+新鲜的水性进样口和出口管）中准备第二个样品时运行设备。
7. 取下出口管和收集管。留在管中的乳液可以通过用注射器推动空气通过它来回收。
8. 关闭泵用于水溶液并将油流速降低至约200μl/ h。更换水相的注射器和管道。再次将油速提高至2,000μl/ h，并以150μl/ h的速度再次启动水溶液，直至出现液滴并降至80μl/ h。保持机油运行可降低阻塞设备的风险。
  注意：偶尔会发生阻塞，因为有些灰尘会进入设备并阻挡设备的流聚焦部分。您可以尝试用手推动注油器将其从设备中冲出来将其取出。
9. 将乳液样品保存在冰上，直到所有样品都准备好。
10. 尽可能多地去除氟化油（底层）而不会损失乳液。将氟化油收集在分开的管中进行回收。
  注意：含有表面活性剂的氟化油可以回收再利用多次。只需通过0.22μm注射器过滤器过滤即可。
11. 为防止蒸发，我建议用一层薄薄的矿物油覆盖乳液样品。
12. 将样品在37℃（或选择的温度）下在热块或培养箱中孵育选定的时间而不摇动。将阴性对照样品放在冰上4°C冰箱中。
  注意：
  1. 孵育时间取决于细胞和培养基。对于M63培养基，我们孵育过夜，对于LB培养基4-8小时就足够了。第一次通过将等分试样孵育不同的时间并在流式细胞仪上进行分析来进行时间过程是值得的（参见Duarte等人，2017年的图2）。
  2. 乳液中的生长受到液滴中提供的介质量的限制。增加细胞生长的方法是在孵育前破坏乳液。然后可将珠子在充足的生长培养基中培养，并且氧气导致比在乳液中孵育时更高的细胞密度。该策略的缺点是所有珠子共享相同的介质。例如，不可能筛选排泄群体感应分子的细胞，然后该细胞从同一珠子激活细胞中的网络。该化学物质也会进入相邻的珠子，而不会产生分子。在这种孵育形式中，一些细胞更可能逃离珠子，然后在生长培养基中的珠子外生长。然后，这些游离细菌可以降低分选纯度，并且可能需要将珠子与游离细菌分离的过滤步骤。
13. 孵育后，将乳液在冰上冷却至少15分钟。这是为了凝固凝胶珠。
恢复凝胶珠
1. 如果您想使用（荧光）显微镜观察液滴，可以将它们移液到显微镜载玻片上。
2. 移取500μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）至乳剂层。
3. 在乳液中加入20-50μl1H，1H，2H，2H-全氟辛醇（PFO）。
4. 将管短暂涡旋（5秒）并短暂离心（10秒，2,500 x g ）。
5. 乳液（白色）现在应该消失了。如果还剩下一些乳液，重复最后两步（即，添加更多PFO，涡旋和离心）。
6. 你现在管中有三个阶段。从下到上：氟化油和PFO，含有珠子和矿物油的PBS（如果添加）（图3）。通过移液将PBS相转移至新鲜的1.5ml微量离心管中。尝试在不加油的情况下尽可能多地获得它。如果您还转移了一些油，将PBS再次转移到新的1.5 ml微量离心管中。油往往会粘在管壁上。
  注意：将矿物油和含有PFO的氟化油分别作为化学废物处理。
7. 如果您需要染色细胞（例如，使用Syto 9），您现在可以这样做。如果它们已经发荧光，您可以继续下一步。
  
  图3.破乳后的三个阶段
排序凝胶珠
1. 为了防止FACS堵塞，将样品通过50μmCellTrics筛网过滤到1.4 ml螺旋盖管中。
2. 使用镊子，将带有样品的1.4 ml试管放入5 ml圆底管中，该管适合流式细胞仪。像这样，您的样品体积很小，无法在管底部进行分类。
3. 在流式细胞仪上分析/分选珠子。许多大学将有一个设施来帮助你解决这个问题。
4. 使用100μm喷嘴和适用于检测细胞荧光的激光和滤光片（488 nm激光，用于GFP的530/30 nm滤光片）。
5. 侧向散射（SSC-W）的宽度与前向散射（FSC-H）的高度是散射参数的组合，其将珠子与其他粒子（游离细菌，琼脂糖碎片，灰尘）或电子噪声分离得最好。机器。因此，首先在SSC-W-FSC-H点图上对所有珠子（有和没有小菌落）进行门控（图4A）。为了分离有和没有微集落的珠子，我们使用SSC-H-FSC-H点图（图4B）。
6. 可以设置FSC-H和SSC-H的阈值，以便不记录小于珠子的粒子。
7. 测量您的对照（未孵育的珠子，与WT细胞的珠子......）。
8. 在荧光直方图（图4C）或FSC-H-荧光点图上设置具有感兴趣荧光的珠子的门，例如5％具有最高荧光的珠子。
  
  图4.门控策略。 A.侧向散射（SSC-W）与前向散射（FSC-H）高度的宽度是散射参数的组合，可将珠子与其他散珠最佳地分开颗粒（游离细菌，琼脂糖碎片，灰尘）或机器的电子噪音。因此，我们首先在SSC-W-FSC-H点图上对所有珠子（有和没有小菌落）进行门控。 B.然后，我们在SSC-H-FSC-H点图中绘制门控珠，用于对具有微菌落的珠进行门控。阴性对照应仅包含没有微菌落的珠子。 C.然后我们绘制含有微菌落的珠子的荧光作为直方图，并设置分选的门，例如5％最亮的珠子。
9. 将它们分成含有200μlLB培养基的1.5ml管。
  注意：当使用100μm喷嘴分选时，50μm琼脂糖珠实际上会破裂。这对于从珠子中回收细菌是方便的，因为不必进行额外的琼脂糖消化和/或融化。如果对于实验来说保持珠子完整是很重要的，可以在分选前加强它们，例如用一层聚丙烯酰胺（Spencer et al。，2016）。
10. 将珠子在预热的LB-琼脂平板（补充有适当的抗生素）上铺板并在37℃下孵育过夜。我们通常将每个分选的样品放在两个大的LB琼脂平板（14cmØ）上，并且通常恢复＆gt;比收集的珠子数多10倍的菌落。
11. 来自平板的菌落可以使用玻璃珠单独挑选或重新悬浮在培养基中。重悬的文库可以在-80℃下作为甘油储液（15％v / v）储存。可以通过测序，（单细胞）流式细胞术，平板阅读器实验等分析样品例如。甘油储备可用于开始该方案的另一轮。

数据分析

为了分析和绘制分选过程中记录的流式细胞仪数据，我们使用程序FlowJo并应用如图4所示的门控策略。
通过测序，（单细胞）流式细胞术和平板读数器实验分析文库和/或单个克隆例如将指示您是否富含所需特性以及是否需要另一轮分选。有关分析库的示例，请参见Duarte et al。（2017）。

笔记

计算细胞数量：

确定液滴的直径
1. 用显微镜照相机拍摄显微镜尺。
2. 使用Photoshop（或类似程序）的测量工具确定有多少像素对应1μm。
3. 拍摄水滴（作为单层）。不要使用盖玻片，因为这可能会扭曲直径测量值。
4. 以像素为单位测量它们的直径（d）。
5. 以μm为单位计算直径。
计算液滴的体积（V）

r：半径
1 m 3 = 1,000 L
示例：d =50μm→r = 25 x 10 -6 m→V = 6.5 x 10 -14 m 3 = 6.5 x 10 -11 L
选择您想要的细胞/液滴数量
根据泊松分布将细胞分布成液滴
e = 2.71828（欧拉数）
λ：平均细胞数/液滴
k：液滴中的细胞数（0,1,2,3,4 ......）
泊松分布计算器可以在网上找到，例如： http://stattrek.com/online-calculator /poisson.aspx
例如：λ= 0.3→P（0,0.3）= 0.74; P（1,0.3）= 0.22; P（2,0.3）= 0.033; P（3,0.3）= 0.003。
这意味着，如果平均我们有0.3个细胞/液滴，我们将有74％的空液滴，22％的液滴与1个细胞，3.3％的液滴与2个细胞和0.3％的液滴与3个细胞。
0.3个细胞/液滴的平均值是空液滴和具有多个细胞的液滴之间的良好平衡。
将600nm处的光密度（OD 600 ）转换为细胞密度
1. 要将测得的OD 600 与细胞密度相关联，您需要根据细胞类型校准仪器。
2. 以下是如何执行此操作的详细协议示例：
  http://delrio.dcccd.edu/jreynolds/microbiology/2421/lab_manual /counts.pdf。
3. 对于 E。大肠杆菌，粗略估计OD 600 1对应于5 x 10 8 -1 x 10 9 细胞/ ml 。
计算细胞稀释度
例：
1. 我们的液滴直径为50微米。
2. 我们想要平均0.3个细胞/液滴。
3. 我们校准OD 600 为1对应于5 x 10 8 细胞/ ml。
4. 我们测量了我们培养物的OD 600 为0.2。
5. 使用等式（1）我们计算出液滴的体积为6.5 x 10 -11 L，这意味着，我们有1.5 x 10 10 液滴/ L和1.5 x 10 7 液滴/ ml水溶液。
6. 因此，对于平均0.3个细胞，我们需要0.3×1.5×10 5个细胞/ ml = 4.5×10 6个细胞/ ml。
7. OD 600 为1，相当于5×10 8 细胞/ ml，4.5×10 6 细胞/ ml对应于OD _{600 的0.009。这意味着我们样品的最终OD 600 应为0.009。当我们测量OD 600 为0.2时，我们需要将细胞总体稀释22倍。通过将细胞与琼脂糖混合来实现2倍稀释，因此我们制备11倍稀释液。}
8. 这些计算将为您提供细胞密度的第一个指示。如果流式细胞术分析（图4）表明过多或过少的珠子含有细胞，则应在下一个实验中相应地调整细胞密度。
9. 您的细胞可能会沉淀在注射器和管道中，导致进入设备的细胞数量随时间减少，从而导致比泊松分布预期更多的空液滴。这种效应的延伸取决于细胞类型，溶液粘度，管道长度和实验持续时间。为了防止它，您可以使用密度匹配代理，如Percoll或alginate。有关详细信息，请参阅Devenish et al。（2013）。

食谱

M63培养基（补充0.2％（w / v）甘油，0.025％（w / v）酪蛋白氨基酸，0.00005％（w / v）硫胺素）
准备5x库存
1. 将以下物质添加到800 ml dH 2 O：
  10 g（NH 4 ） 2 SO 4
  68 g KH 2 PO 4
  2.5g FeSO 4 ·7H 2 O
2. 使用KOH将pH调节至7.0
3. 用dH 2 O将音量调节到1 L
4. 通过高压灭菌消毒
准备1x工作解决方案
1. 添加以下内容：
  200毫升5倍库存
  0.1毫升0.5％盐酸硫胺素
  1.25毫升20％酪蛋白氨基酸
  10毫升无菌20％甘油
  1毫升无菌1M MgSO 4
  抗生素（例如，50μg/ ml卡那霉素）
2. 使用dH 2 O将音量调节至1 L.
1x PBS
1. 将以下物质添加到800 ml dH 2 O：
  8克NaCl
  0.2克KCl
  1.44克Na 2 HPO 4
  0.24克KH 2 PO 4
2. 用HCl调节pH至7.4
3. 加入蒸馏水至总体积1L
4. 通过高压灭菌消毒
LB媒体
1. 将以下物质添加到800 ml dH 2 O
  10克胰蛋白胨
  5克酵母提取物
  10克NaCl
2. 使用NaOH将pH调节至7.0
3. 用dH 2 O将音量调节到1 L
4. 通过高压灭菌消毒
LB琼脂
1. 将以下物质添加到800 ml dH 2 O
  10克胰蛋白胨
  5克酵母提取物
  10克NaCl
  15克琼脂
2. 使用NaOH将pH调节至7.0
3. 用dH 2 O将音量调节到1 L
4. 通过高压灭菌灭菌
5. 高压灭菌后，冷却至50°C，加入抗生素（如果需要，例如，50μg/ ml卡那霉素），倒入培养皿中。
6. 让它变硬，然后倒转并在4°C下储存

致谢

我感谢IçvaraBarbier的批判性阅读。我感谢瑞士国家科学基金会（项目31003A_175608）的资助。该方案改编自（Duarte et al。，2017）中公布的程序。作者声明没有竞争利益。

参考

戴维斯，D。（2012年）。通过流式细胞仪进行细胞分离。方法Mol Biol 878 ：185-199。
Devenish，S.R.，Kaltenbach，M.，Fischlechner，M。和Hollfelder，F。（2013）。液滴作为蛋白质纳米技术的反应区。方法Mol Biol 996：269-286。
Duarte，J.M。，Barbier，I。和Schaerli，Y。（2017）。凝胶珠中的细菌菌落用于高通量筛选合成生物学中的文库。 ACS Synth Biol 6（11）：1988-1995。
Fischlechner，M.，Schaerli，Y.，Mohamed，M.F。，Patil，S.，Abell，C。和Hollfelder，F。（2014）。嵌入仿生凝胶壳珠中的酶催化剂的演变。 Nat Chem 6（9）：791-796。
Meyer，A.，Pellaux，R.，Potot，S.，Becker，K.，Hohmann，H.P.，Panke，S。和Held，M。（2015）。通过在纳升反应器内部使用遗传编码的产品传感器优化全细胞生物催化剂。 Nat Chem 7（8）：673-678。
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