材料和试剂

铝箔
细胞过滤器100μm尼龙（Corning，目录号：431752）
离心管15 ml（Corning，目录号：430790）
离心管50 ml（Corning，目录号：430828）
康宁®瓶顶真空过滤系统（康宁，目录号：430796）
盖玻片24 x 50 mm（Knittel Glass，目录号：VD1 2450 Y100A）
盖上4ml小瓶（J.G.Finneran，目录号：5360-13）
Finnpipette ®移液器吸头5 ml（Sigma-Aldrich，Thermo Fisher，目录号：P2924）
玻璃插件（J.G Finneran，目录号：401BS-530）
显微镜载玻片3 x 1英寸（Knittel Glass，目录号：VA31100 001FKB）
非无菌手术刀片（Bar Naor，目录号：BN10011-00）
纸张（Romical，目录号：322-05004040）
PARAFILM ® M密封膜（BRAND，目录号：701605）
巴斯德吸管打开尖端150毫米（Hilgenberg，目录号：3150101）
培养皿90 x 15 mm（MINIPLAST，目录号：820-090-01-017）
安全锁管，1.5 ml，Eppendorf质量 TM ，无色（Eppendorf，目录号：0030120086）
安全锁管，2.0 ml，Eppendorf质量 TM ，无色（Eppendorf，目录号：0030120094）
盖上2毫升小瓶（CHROMSERVIS，目录号：1076-8002-C）
硅胶管8 x 12 mm（Chen Samuel，目录号：054080120）
无菌移液器1毫升（Alexred，目录号：ALP ON1E1）
小瓶2毫升（J.G Finneran，目录号：32008-1232）
小瓶4毫升（J.G.Finneran，目录号：34013-1545）
硝酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：256064）
氯化钙二水合物（默克，目录号：102382）
纤维素酶R10（Duchefa Biochemie，目录号：C8001）
D-甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M4125）
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：E6635）
Ficoll ® PM 400（Sigma-Aldrich，目录号：F4375）
荧光素二乙酸酯溶液（Sigma-Aldrich，目录号：F7378）
Gamborg的B-5基础盐混合物（Sigma-Aldrich，目录号：G5768）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H7006）
盐酸37％（w / w）（Bio Basic，目录号：HC6025）
异丁基苯（Sigma-Aldrich，目录号：113166）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P4504）
Macrozyme R10（Duchefa Biochemie，目录号：M8002）
MES钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：M3885）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：322415）
正己烷HPLC（Biosolve，目录号：082906）
柠檬酸三钠二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C8532）
氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：221465）
次氯酸钠5％（Romical，目录号：73-7586-1400）
磷酸氢二钠（Sigma-Aldrich，目录号：255793磷酸氢二钠七水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S2429）
磷酸二氢钠一水合物（Sigma-Aldrich，目录号：S3522）
无菌双蒸水（DDW）
蔗糖（DAEJUNG CHMICAL＆amp; METALS，目录号：7501-4400）
Viscozyme（纤维素分解酶混合物）（Sigma-Aldrich，目录号：V2010）
TEX缓冲区（见食谱）
酶解决方案（见食谱）
悬浮缓冲液（见食谱）
0.5 M EDTA，pH 8（参见食谱）
30％Ficoll（见食谱）
5％Ficoll（见食谱）
0.2 M磷酸钠，pH 8（见食谱）
裂解缓冲液（见食谱）
1 M甘露醇（见食谱）
0.2 M磷酸钠，pH 7.5（见食谱）
Vacuole缓冲液（0％Ficoll）（见食谱）
80％甲醇（见食谱）
0.1 M柠檬酸盐（见食谱）
0.2 M磷酸氢二钠（见食谱）
柠檬酸盐磷酸盐缓冲液，pH 5.4（见食谱）
异丁基苯80μg/ ml（见食谱）
己烷标准溶液（见食谱）

设备

手术刀手柄＃3（Bar Naor，目录号：BN400-3-WH）
烧杯400毫升（IsolabLaborgeräte，目录号：025.01.400）
烧杯600毫升（IsolabLaborgeräte，目录号：025.01.600）
Finnpipette TM F3可变容量单通道移液器100-1,000μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：4640060）
Finnpipette TM F3可变容量单通道移液器20-200μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：4640050）
Finnpipette TM F3可变容量单通道移液器2-20μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：4640030）
Fisherbrand TM 单孔橡胶塞13号（Fisher Scientific，目录号：14-135S）
离心机5430 R（Eppendorf，型号：5430 R，目录号：022620603）
离心机5810 R（Eppendorf，型号：5810 R，目录号：5811000320）
流罩
血细胞计数器XB.K25 0.10 mm 1/400 mm 2 （QIUJING，目录号：02270113）
孵化器在37°C
Kenzan插花针尖支架1.5寸
光学显微镜（奥林巴斯，型号：BH-2）
轨道振动筛（Thermo Fisher Scientific，型号：Forma TM 3250）
SpeedVac（赛默飞世尔科技，Savant，型号：SVC-100H）
标准剪刀弯曲12厘米（Bar Naor，目录号：BN11-011-12）
旋塞阀，直式PP＆amp; HDPE，外径8 mm（KARTELL，目录号：374）
Tissulyzer II（QIAGEN，目录号：85300）
TransferPette ® S，变量500-5,000μl（品牌，目录号：704782）
镊子弯曲＃7（Bar Naor，目录号：BN-7-W）
镊子超精细＃5（Bar Naor，目录号：BN78320-5）
超声波清洗机（Cole-Parmer，型号：8845-6）
真空过滤瓶2L（Corning，目录号：5340-2L）
真空泵（KNF，目录号：N 840.3 FT.18）
Vortex-genie 2（科学工业，型号：Vortex-Genie 2，目录号：G 560E）

程序

在原生质体分离前1天，从温室中生长的矮牵牛植物中去除所有开放的花（这将确保所有开放的花处于相似的发育阶段，即，第二天开花，图1）。

花卉采集和原生质体分离准备（第1天）
1. 从温室里种植的植物中收集开放的花朵。选择完全打开的花（在开花期）并将它们放入装有75ml自来水的600ml烧杯中。对于标准程序，在步骤A7使用24朵花，大致适合四个90 x 15 mm培养皿。
2. 所有后续步骤必须在流罩中进行，以保持无菌状态。
3. 准备3个烧杯，一个含有250毫升5％次氯酸盐，另外两个含有350毫升DDW。另外，准备四个含有20毫升酶溶液的90 x 15毫米培养皿。
4. 在5％次氯酸盐烧杯中用一对镊子浸泡每朵花30秒，然后通过在DDW烧杯中小心地浸泡和摇晃连续冲洗两次。
5. 将灭菌的花放在干净的无菌纸上，并在花冠下方约1-2厘米处切割（图1）。去除所有花器官：雄蕊，花管，花萼，等。（只留下花冠）。重复所有花朵。
  
  图1.在花冠下方切割以去除所有花器
6. 使用kenzan针尖支架轻轻刺穿每个花冠，正面朝上（图2）。立即进行下一步以防止花冠脱水。
  
  图2.将花冠放在kenzan针尖支架上，正面朝上
7. 将花切成两半，小心地将其放入含有酶溶液的培养皿中，其正面朝下。对所有花朵重复此步骤（每个盘子大约适合12个半球）（图3）。
  
  图3.放置在含有酶溶液的培养皿中的花半球
8. 关闭四个培养皿，用Parafilm密封，盖上铝箔，在黑暗中孵育过夜（约12小时），温度为25°C。
从液泡中提取原生质体和糖苷（第2天）
原生质体分离和液泡分离
1. 在室温下以10 rpm的速度摇动盖板不超过30分钟。
2. 将100-μm细胞过滤器放在四个50-ml离心管的顶部。
3. 用3 ml悬浮缓冲液润湿所有过滤器。
4. 用手再次轻轻摇动平板几秒钟（重悬细胞）。使用无菌塑料1毫升切割移液器吸头，小心地从一个培养皿中收集液体，倾斜50毫升管并覆盖在细胞过滤器上。重复此步骤，直到所有液体都通过网孔（图4）。对剩余的三个板重复此步骤，将液体收集到另外三个50毫升管中。
  
  图4.收集原生质体
5. 在除去酶液体混合物后，立即使用5ml悬浮缓冲液洗涤两个培养皿（这样可以收集培养皿中剩余的任何原生质体）。在两个管之间均匀分配最终液体。对其他两道菜也一样。
6. 将5毫升悬浮缓冲液轻轻滴在每个细胞过滤器上，从粘在网上的花瓣碎屑中释放原生质体。
7. 使用摆动转子在室温（RT）下以100 xg 离心（5810R）四个管15分钟，加速度设置为2并且制动（减速）为0.活体原生质体将漂浮，而细胞碎片将沉淀（图5）。保持管稳定，因为运动会使层混合。
  
  图5.离心后形成的具有活原生质体的紫色层
8. 准备真空泵和真空过滤瓶，用巴斯德吸管连接到管上（图6）。
  
  图6.连接真空泵的过滤瓶
9. 在阀门关闭的情况下，启动真空泵并用原生质体轻轻地将移液管推过上层。当移液管通过原生质体层时，缓慢打开阀门以启动抽吸并吸取碎片颗粒和尽可能多的介质但不吸收原生质体（视频1）。记得在原生质体到达管底之前关闭阀门并减少吸力，否则产量会非常低。
  
  视频1
10. 用悬浮缓冲液将每管加至25毫升。
11. 重复步骤B7-B10两次。
12. 再次离心（4 th 时间）并使用巴斯德吸管移除 ca。 22ml的碎片，留下3ml原生质体溶液。不要在每个管中留下超过3毫升的裂解液。
13. 使用血细胞计数器在显微镜下计数细胞（参见数据分析;产量应 ca。 14 x 10 6 原生质体/ ml）（图7）。
  
  图7.原生质体的光学显微镜。比例尺=45μm。
14. 向每个含原生质体的管中加入10.5ml温热（37℃）裂解缓冲液，移液5-8次（切割尖端）并在室温下孵育2分钟。
15. 将每个管的内容物均匀地分成两个15毫升的管。现在你将有8管。
16. 将5毫升尖端沿墙壁侧面放置并靠近液体表面，每管加入4毫升5％Ficoll。
17. 如在步骤B16中，向每个管中加入1.5ml冰冷的液泡缓冲液（0％Ficoll）。
18. 使用摆动转子在室温下以2,000 x g 离心所有8个管45分钟，加速度= 2且制动= 0。
19. Vacuoles将在0％和5％的Ficoll分数之间积累。
20. 轻轻取出不含液泡的上部Ficoll层（透明），小心地将液泡（ ca。 1.5 ml）转移到带有200μl尖端（带切口末端）的2 ml Eppendorf管中，沿着管壁插入它。通过光学显微镜分析液泡完整性（图8）。 Vacuoles可以在4°C下储存长达1天（见注6）。
  
  图8.离心后含有液泡的Ficoll级分。完整液泡的光学显微镜显示在插图中。比例尺=10μm。
从液泡中提取糖苷
1. 将0.5ml液泡溶液转移到2ml Eppendorf管中（至少一式三份以进行统计学分析）。
2. 每管加入1.2毫升80％甲醇。
3. 剧烈旋转10秒钟。
4. 超声20分钟（60赫兹），每5分钟涡旋10秒钟。
5. 剧烈旋转10秒钟。
6. 在室温下以16,000 x g 离心（5430R）15分钟。
7. 在室温下孵育1分钟。
8. 在不打扰沉淀的情况下，将上清液（ ca。 1.5 ml）从每个试管转移到新的2 ml Eppendorf试管中。
9. 在加热的速度 - 真空中完全蒸发（直至过夜）所有液体（<300> ，36°C ）。
挥发性糖苷配基的分馏（第3天）
1. 每管加入900μl温热（37°C）柠檬酸盐 - 磷酸盐缓冲液，加入干燥的提取糖苷颗粒。
2. 剧烈涡旋直至颗粒溶解。
3. 每管加入150μlVisco酶酶混合物。
4. 剧烈旋转10秒钟。
5. 小心地（非常缓慢地）向每个管中加入728μl己烷标准溶液。
6. 在黑暗中37°C静态孵育8小时。
7. 在转速为300转/分钟时摇动2小时。
8. 在室温下以10,500 x g 离心10分钟。
9. 将上部己烷相转移到4ml玻璃小瓶中。将样品保持在-20°C。
10. 将100μl己烷溶液转移到置于2 ml玻璃瓶中的100μl插入物中。
11. 继续进行GC-MS分析。

数据分析

为了测定液泡中的挥发性糖苷配基，必须进行至少三次用不同组的24朵花进行的单独实验。为了确定每个液泡中螯合的糖苷配基的量，我们计算用于糖苷配基提取的空泡（来自单独的实验）并将糖苷配基量除以空泡的数量。用Excel计算每个液泡的糖苷配基数的标准误差。
为了评估原生质体活力，我们将其与荧光素二乙酸盐溶液一起孵育，如Cna'ani et al。（2017）所述。
为了评估原生质体和液泡的纯度，我们提取了蛋白质，并用针对液泡膜V型H + ATP酶（V-ATPase，液泡膜），细胞溶质果糖-1的ε亚基的抗体进行了蛋白质印迹分析， 6双磷酸酶（cFBPase，胞质溶胶），苯丙氨酸氨裂解酶（PAL，内膜/胞质溶胶）和主要捕光叶绿素a / b蛋白（LHCII，plastid）（Vainstein和Sharon，1993; Howles 等。，1996; Dima et al。，2015; de Michele et al。，2016; Cna'ani et al。，2017）。
在糖苷水解之前加热和延长样品的蒸发时间促进了挥发物的蒸发，并且对于避免来自原生质体的糖苷配基可能污染液泡部分是至关重要的。建议在水解前分析一份用己烷提取的样品，以确认不存在挥发性糖苷配基。
为了计算原生质体的浓度（细胞/ ml），将它们稀释10倍并将10μl等分试样置于血细胞计数器计数网格上而没有盖玻片（图9A）。原生质体在4个不同的方块中计数（图9B）。使用以下公式：细胞/ ml =每平方的平均细胞数×稀释因子×10 4 。

图9.原生质体浓度计算。 A.实验中使用的血细胞计数器。 B.扩大计数网格。用于细胞计数的方块以红色显示。

笔记

从Danziger-Dan Flower Farm（Mishmar Hashiva，Israel）获得生根矮牵牛苗（ Petunia x hybrida L.Line Blue Ray）。植物在25/20℃的日/夜温度范围和12/12小时光/暗光周期下在温室中生长2个月，光照期从上午08:00开始。 br />
该协议通常适用于'Blue Ray'。一些实验也用矮牵牛品种P720进行。
在第1天，步骤A8，由于没有足够的水解时间或广泛的细胞裂解，更短和更长的孵育时间将导致原生质体产量低。
在第2天，强烈建议将真空泵保持靠近离心机，因为活的原生质体层往往会扩散和重悬，从而降低原生质体的产量。
使用带切边的尖端进行所有原生质体和液泡处理。
建议在空泡分离后立即进行糖苷提取。如果需要，液泡可以在4°C下储存长达1天。

食谱

TEX缓冲液（500毫升）
1. 混合1.55g Gamborg B5盐，250mg MES，375mg CaCl 2，，125mg NH 4 NO 3 ，68.46mg蔗糖
2. 用蒸馏的H 2 O使其达到500ml
3. 用HCl调节pH值至5.7
4. 用瓶顶真空过滤系统过滤消毒
5. 在室温下储存长达2个月
酶溶液（120毫升）
1. 在600ml烧杯中混合800mg macrozyme R10和1.6g纤维素酶R10
2. 用TEX缓冲液加入120毫升
3. 以150转/分钟摇动30分钟
4. 分成三个50毫升离心管，在3,500 x g 离心15分钟
5. 将上清液转移到新管中
6. 新鲜
悬浮缓冲液（500毫升）
1. 混合68.46毫克蔗糖，1.2克HEPES，6克KCl，600毫克CaCl 2
2. 用蒸馏的H 2 O使其达到500ml
3. 用HCl将pH调节至7.2
4. 用瓶顶真空系统过滤消毒
5. 在室温下储存长达2个月
0.5 M EDTA，pH 8（8 ml）
1. 在50毫升管中称取14.89克EDTA
2. 加入30毫升DDW
3. 用NaOH颗粒调节至pH8
4. 用DDW加入40毫升
5. 高压灭菌器
6. 在室温下储存长达3个月
30％Ficoll（50 ml）
1. 在50毫升管中称取15克Ficoll
2. 用65°C加入50毫升 - 预热和高压灭菌的DDW
3. 在65°C摇动直至粉末完全溶解（不超过1小时）
4. 高压灭菌器
5. 在室温下储存长达2个月
5％Ficoll（50 ml）
1. 在50毫升管中混合25毫升裂解缓冲液和25毫升液泡缓冲液
2. 新鲜并保持在室温
0.2 M磷酸钠，pH 8（10 ml）
1. 在50ml管中称取138mg NaH 2 PO 4 ·H 2 O.用DDW加入5毫升并涡旋
2. 在50ml管中称取536.5mg Na 2 HPO 4 ·7H 2 O.用DDW和涡旋加入10毫升
3. 混合0.54ml NaH 2 PO 4 ·H 2 O溶液和9.47ml Na 2 HPO在新鲜的15毫升管中 4 ·7H 2 O溶液
4. 在室温下储存长达3个月
裂解缓冲液（100 ml）
1. 在400毫升烧杯中混合20毫升甘露醇1米，33.35毫升Ficoll 30％，2毫升EDTA 0.5毫升，2.5毫升磷酸钠0.2米（pH 8）
2. 用DDW带15毫升
3. 新鲜，保持在37°C
1 M甘露醇（50 ml）
1. 在300毫升烧杯中称取9.1克甘露醇
2. 用DDW加入50毫升
3. 在37°C摇动直至粉末完全溶解
4. 提前一天
0.2 M磷酸钠，pH 7.5（10 ml）
1. 在50ml管中称取138mg NaH 2 PO 4 ·H 2 O.用DDW加入5毫升并涡旋
2. 在50ml管中称取536.5mg Na 2 HPO 4 ·7H 2 O.用DDW和涡旋加入10毫升
3. 混合1.6毫升NaH 2 PO 4 ·H 2 O溶液和8.4毫升Na 2 HPO 4 ·7H 2 O在15毫升管中
4. 在室温下储存长达3个月
Vacuole缓冲液（0％Ficoll）（50 ml）
1. 将12.5 ml甘露醇1 M，1.25 ml磷酸钠0.2 M pH7.5,200μlEDTA混合在50 ml管中
2. 用DDW加入50毫升
3. 新鲜，保持冰
甲醇80％（40毫升）
1. 将32 ml甲醇与8 ml DDW在50 ml管中混合
2. 新鲜
柠檬酸盐0.1 M（40 ml）
1. 在50毫升管中称取768毫克柠檬酸
2. 用DDW加入40毫升
3. 新鲜
0.2 M磷酸氢二钠（40 ml）
1. 在50毫升管中称取1.128克磷酸钠
2. 加入50毫升DDW
3. 新鲜
柠檬酸盐缓冲液，pH 5.4（50 ml）
1. 将22.2毫升0.1M柠檬酸与27.8毫升0.2M Na 2 HPO 4 在50毫升管中混合
2. 新鲜
异丁基苯（80μg/ ml）
1. 从储备溶液中取1μl，用999μl己烷稀释并在1.5 ml管中涡旋
2. 保持在-20°C长达1年
己烷标准溶液（10个样品）
1. 将7.2 ml己烷与80μl异丁基苯（80μg/ ml）混合
2. 保持在-20°C长达1年

致谢

所提出的协议是根据Robert et al。，2007年的先前作品生成的。 Fontes et al。，2010; Faraco et al。，2011年和2014年; Pérez-Díaz et al。，2014; Shen et al。，2014和Cna'ani et al。，2017。这项工作得到了以色列科学基金会（第247/14号授权）和ISF-的支持。国家自然科学基金委员会联合研究计划（第2511/16号授权）。我们感谢Isaac Kaye的支持和帮助。 A.V.是沃尔夫森花卉园主席的现任者。作者声明没有利益冲突。

参考

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