材料和试剂

培养皿（60 x 15 mm）带凸轮（SARSTEDT，目录号：82.1194.500）
显微镜磨砂玻片25 x 75 x 1 mm（Thermo Fisher Scientific，目录号：2951-001T）
显微镜盖玻片22 x 22 mm（VWR，目录号：631-1570）
0.2μm过滤器（聚乙烯砜膜，VWR，目录号：28145-501）
℃。线虫菌株QC114 { etEx2 [（pQC09.6）glo-1p :: GFP :: ras-2 CAAX +（pRF4）rol-6（su1006）] }和QC129 （paqr-2 [tm3410]）（Caenorhabditis Genetics Center / CGC，明尼苏达大学，美国）
电子。大肠杆菌 OP50菌株（CGC，明尼苏达大学，美国）
左旋咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：L9756）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：795488）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4 ）（西格玛奥德里奇，目录号：P2222）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31434）
Bacto蛋白胨（BD，目录号：211677）
琼脂粉（VWR，目录号：20767.298）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C8667）
硫酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：M2643）
氯化钙（Sigma-Aldrich，目录号：C8106）
琼脂糖（Sigma-Aldrich，目录号：A9539）
磷酸盐缓冲液（见食谱）
α-D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：158968-500G）
乙醇（95％，Solveco，目录号：1000）
磷酸盐缓冲液（见食谱）
M9缓冲液（见食谱）
线虫生长培养基（NGM）（见食谱）
琼脂糖垫（见食谱）
左旋咪唑溶液（见食谱）

设备

用于蠕虫维护的标准培养箱（Panasonic / Sanyo冷却培养箱，型号：MIR 254）
40x水浸物镜
立体显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica MZ75）
激光扫描共聚焦显微镜（蔡司，型号：LSM 700）

软件

Zen 2012 SP5软件（蔡司）
Microsoft Excel for Mac 2011

程序

℃。线虫应变和维护
转基因菌株QC114携带 etEx2 染色体外转基因，支持在肠道细胞中表达膜相关的异戊烯化GFP（Mörck et al。，2009），可从℃。线虫遗传学中心（CGC; MN; USA）。 etEx2 转基因应该通过采摘滚子来维持，并且可以容易地进入任何感兴趣的突变体或遗传背景中;下面的例子假设 etEx2 已经进入突变背景，例如 paqr-2（tm3410），其中膜流动性通过膳食SFAs明显减少（Svensk et al。，2016; Devkota et al。，2017）。
注意：转基因是染色体外阵列的形式，但这不是问题，因为实验仅在GFP阳性蠕虫中进行（图1B）（视频1）。
1. 在20℃下在60mm平板上培养转基因蠕虫，预先接种约200μl E的过夜培养物。大肠杆菌 OP50，保持在LB平板上并保持在4°C（每6-8周重新划线）（Stiernagle，2006）。
2. 将怀孕的雌雄同体漂白并使卵在M9缓冲液中孵化过夜（Stiernagle，2006; He，2011）。将同步的L1幼虫转移到含有20mM葡萄糖的新平板上。使用过滤灭菌（使用0.2μm过滤器）和新制备的1M葡萄糖储备溶液制备20mM葡萄糖平板，将其在高压灭菌后加入冷却但仍熔化（~60℃）的NGM中;用 E种植这些平板。大肠杆菌 OP50如上所述。
  注意：葡萄糖很容易被膳食大肠杆菌转化为SFA，导致paqr-2突变体中的膜硬化（Devkota等，2017）。对照和paqr-2突变体在缺乏葡萄糖的正常培养板上具有相同的膜流动性。
3. 在20°C温育16小时后，将转基因蠕虫（滚筒）放在2％琼脂糖垫上，加入100毫升左旋咪唑（溶于水中;使蠕虫麻痹），并盖上盖玻片。
  注意：
  1. 在过夜孵化后，蠕虫通常处于L2阶段;在这个早期阶段，etEx2转基因强烈表达并清楚地标记肠道质膜。
  2. 每个琼脂糖垫在1-1.5μl的100mM左旋咪唑中装载20-25个转基因蠕虫（滚筒）。此步骤对于避免蠕虫抽搐或移动至关重要。
FRAP配置：共聚焦显微镜
1. 打开显微镜，激光和计算机。推出Zeiss Zen 2012软件。在“定位”选项卡中，单击“显微镜控制”。选择明场或荧光。选择绿色（FSet10 wf）滤光片进行荧光。整个实验用40x水浸物镜（Numerical Aperture 1.1）进行。
2. 转到Acquisition选项卡以开始新的FRAP配置。使用Smart Setup，选择EGFP染料和488 nm激光。
3. 确保物镜是40倍水浸物镜。对于连续共焦扫描，使用帧模式，12位强度分辨率超过256 x 256像素（数字变焦4倍），像素停留时间为1.58微秒。使用单向扫描并将针孔设置为1个通风装置（图1A）。
4. 对于光漂白，请选择时间序列，漂白和区域选项卡。选择合适的漂白区域形状和大小。该协议基于半径为7像素的圆形区域。整个实验包含200个循环，每个循环运行242.04毫秒（时间序列选项卡）。可以使用50％激光功率传输使用20次迭代来设置漂白。设置为在开始光漂白之前进行10次扫描。在这些设置下，大约60-70％的信号被漂白。
5. 保存配置。
显微镜和数据采集
1. 在“定位”选项卡中，在显微镜控制下，使用明亮区域查找蠕虫。重要的是蠕虫很好地固定不动：任何运动都会影响FRAP测量。
2. 在Acquisition选项卡中，打开已保存的FRAP配置（从步骤B5开始）。确保信号既不饱和也不低于检测水平（饱和度和缺乏荧光信号通常分别表示为红色和蓝色斑点）。这可以使用“Master Gain”和“Digital Offset”功能轻松调整。请注意，必须单击“范围指示器”选项卡才能显示饱和度。
3. 选择一个未饱和的肠细胞区域，并使用半径为7像素的圆形区域进行光漂白（图1B）。
  注意：根据我们的经验，没有必要选择富含GFP的质膜作为对照区域;扫描引起的漂白效果似乎同样影响所有地区。
4. 开始连续扫描（视频1）。
  
  视频1
5. 扫描后，单击“平均ROI”选项卡，然后在样本中选择未漂白的控制参考区域。这将用于补偿漂白对整体信号的影响。
6. 保存图像和表格（.txt格式），显示整个实验的荧光强度。

数据分析

在Excel中打开文本文件。所有数据分析，图表和统计数据均使用Excel程序执行。
补偿由于重复扫描导致的荧光损失：重复扫描和成像会随着时间的推移降低整体荧光。这在每个FRAP实验中通过使用参考区域并确定其随时间的荧光减少的斜率来补偿;通常，参考数据显示线性下降，并且可以通过图形拟合来计算斜率。例如，如果漂白率为每秒0.25％，则FRAP测量区域中的每个数据点应除以1 - （0.0025 x经过的秒数）。这会产生补偿数据。
将漂白后荧光设置为零：确定最低强度值（漂白后立即）并从所有强度中减去该值，从而将漂白后荧光设置为零。
标准化：确定漂白前五次测量的平均强度。将所有强度除以该值。现在所有强度都应该在0到1之间（除前五个中的一些可能高于前五个的平均值）。
绘制数据：FRAP（标准化）与时间（秒）的百分比。在所示的例子中，FRAP是在20mM葡萄糖培养的野生型（N2）和 paqr-2 突变体蠕虫上进行的（图1C）。
确定恢复后的平稳期：计算最后五次测量的平均值（假设此时恢复已达到稳定或接近平稳）。这相当于移动部分，即，最大可恢复荧光。
确定恢复的半衰期（T half ）：确定强度恢复到什么时间点到最大恢复的一半（通过检查数据凭经验完成）。对一组中的每个单独实验执行此操作，然后获得平均值±平均值的标准误差。使用 t -test确定T half 值之间的显着性。这里的例子表明，当用20mM葡萄糖培养时， paqr-2 突变体蠕虫的移动部分减少，恢复速度慢于N2蠕虫（图1D）。

图1. FRAP设置，漂白和数据分析。 A. ZEN软件窗口的屏幕截图，显示了漂白的共焦设置。 B.在肠细胞质膜上的异戊烯化GFP标记的图示。箭头表示清晰的肠膜，红色圆圈表示FRAP分析过程中漂白区域的大小。黄色矩形显示实验期间未漂白的控制参考区域。 C.FRAP曲线显示在20mM葡萄糖上生长的野生型N2和 paqr-2 突变体的回收率（误差条显示SEM; n = 6-10个蠕虫）。 paqr-2 突变体的恢复速度较慢，移动部分减少。 D.T half 值显示恢复一半最大荧光的时间。 paqr-2 突变体需要更长的恢复时间。用 t -test（双尾;等方差）统计显示重要程度。 ***： P ＆lt; 0.001

笔记

重要的是蠕虫在整个FRAP过程中不会移动。人们通常计划每次实验获得大约6-10个蠕虫的可靠FRAP测量值，实际上通常需要15-20次测量，因为蠕虫偶尔会抽搐或轻微移动。
我们每个蠕虫只进行一次FRAP测量。
请注意，在琼脂糖垫上留下太长时间的蠕虫将无法获得执行实验所需的良好信号。不应使用安装超过60分钟的蠕虫。

食谱

磷酸盐缓冲液
1. 混合66毫升1M无菌K 2 HPO 4 和434毫升1M无菌K 2 HPO 4 （pH 6.0）
2. 在室温下储存
M9缓冲区
1. 溶解3.0g KH 2 PO 4 ，6.0g Na 2 HPO 4 和5g NaCl在蒸馏水中< sub> 2 O并将体积调整为1 L.通过高压灭菌消毒
2. 冷却，然后加入1ml无菌1M MgSO 4
3. 在室温下储存
线虫生长培养基（NGM）
1. 在975ml蒸馏水中加入3g NaCl，2.5g Bacto蛋白胨和20g琼脂。通过高压灭菌灭菌
2. 加入1毫升胆固醇（5毫克/毫升在EtOH中;这绝不是高压灭菌），1毫升1M MgSO 4 ，1毫升1M CaCl 2 和25毫升1M磷酸盐缓冲液（pH 6.0）;后两种溶液分别高压灭菌，然后用作保存在室温下的储备溶液
3. 每个培养皿倒入约10ml培养基并让它们干燥过夜
4. 将板保存在4°C
琼脂糖垫
1. 在M9中微波2％琼脂糖直至熔化
2. 将一滴放在玻璃载玻片上，玻璃载玻片两侧有另外两个带有约0.5毫米常规实验室胶带的玻璃载玻片
3. 在前三个滑块上放置第四个滑块，以便将液滴压平至约0.5 mm的厚度
4. 琼脂糖冷却后滑下顶部载玻片，留下一个新鲜，扁平的琼脂糖垫
5. 存放在潮湿的箱子中，以防止垫子干涸
左旋咪唑溶液
1. 称取2.04克左旋咪唑
2. 加入100毫升蒸馏水
3. 混合直至完全溶解

致谢

我们感谢哥德堡大学的细胞成像中心提供显微镜支持。这项工作由Vetenskaprådet，Cancerfonden，Carl Trygger Stiftelsen，Diabetesfonden和Kungliga Vetenskaps och Vitterhets-Samhället资助。作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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Dancy，B.C.，Chen，S.W.，Drechsler，R.，Gafken，P.R。和Olsen，C.P。（2015）。 13 C-和 15 N-标记策略结合质谱法全面量化 C中的磷脂动力学。线虫。 PLoS One 10（11）：e0141850。
Devkota，R.，Svensk，E.，Ruiz，M.，Stahlman，M.，Boren，J。和Pilon，M。（2017）。脂联素受体AdipoR2及其 Caenorhabditis elegans 同源物PAQR-2可预防膜外源性饱和脂肪酸硬化。 PLoS Genet 13（9）：e1007004。
他，F。（2011）。蠕虫同步。生物协议 Bio101：e56。
Mörck，C.，Olsen，L.，Kurth，C.，Persson，A.，Storm，NJ，Svensson，E.，Jansson，JO，Hellqvist，M.，Enejder，A.，Faergeman，NJ和Pilon，M 。（2009）。他汀类药物抑制蛋白质脂质化并诱导非甾醇产生线虫的未折叠蛋白反应 Caenorhabditis elegans 。 Proc Natl Acad Sci USA 106（43）：18285-18290。
Pilon，M。（2016年）。重新审视以膜为中心的糖尿病观点。 Lipids Health Dis 15（1）：167。
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