材料和试剂

移液器吸头（Corning，AXYGEN ®，目录号：T-1000-B）
筛子（孔径不小于0.20毫米，任何品牌）
无菌1.5 ml微量离心管（Eppendorf ®）
培养皿（NEST Biotechnology，目录号：715001）
实验室薄膜（Parafilm ® M）
Adiantum 孢子
无菌水
NaClO（ALADDIN，目录号：S101636-5kg）
Ca（NO 3 ） 2 （ALADDIN，目录号：C100076-100g）
KNO 3 （ALADDIN，目录号：P111635-500g）
MgSO 4 （Sigma-Aldrich，VETEC TM ，目录号：V900066-500G）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，VETEC TM ，目录号：V900041-500G）
FeCl 3 ·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：31232-250G）
Gellan Gum（Gelzan TM CM，PhytoTechnology Laboratories，目录号：G3251）
Knop的中等液体（见食谱）
Knop的中等固体（见食谱）

设备

1升烧瓶（任何品牌）
无菌镊子（任何品牌）
移液器（Eppendorf ®）
高压灭菌器（松下，型号：MLS-3781L-PC）
超洁净工作台（Esco Micro，型号：SVE-4A1）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Pico TM 21）
恒温照度孵化器（北京鲁西，型号：GZX-400PY）
立体显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica DFC450 C）

程序

用成熟的山毛皮收集羽片。为确保羽片干燥，请将其用干纸包裹1-2天。将干燥的羽片放在筛子上并搅拌，得到深棕色孢子囊和黄色孢子。
注意：孢子囊和孢子可以在4°C下储存。对于高发芽率，建议立即种植。
用15分钟紫外线辐射彻底清洁无菌工作台。
将2毫克孢子囊倒入1.5毫升无菌离心管中，然后在离心管中加入1,000微升5％次氯酸钠溶液。摇动离心管以确保孢子囊完全悬浮。将管子水平放置2分钟（视频1）。然后将500μl5％次氯酸钠溶液加入新的离心管中。

视频1.孢子囊的灭菌和孢子囊孢子的释放
上下移液以悬浮孢子囊。吹出液体后，深棕色孢子囊先沉淀，而淡黄色孢子则慢慢沉淀。当孢子囊仍然悬浮时孢子囊沉淀时，小心地将孢子转移到新的含消毒剂的管中（视频2）。
注意：注意不要制造任何孢子囊，这会增加污染风险。

视频2.从孢子囊中分离孢子
用移液管从离心管中倒出上清液。用1,000μl无菌水清洗孢子。摇动离心管以确保孢子完全悬浮。然后在室温下以12,000 x g 离心2分钟。
重复步骤6。
用移液管从离心管中倒出上清液。将1,000μl液体Knop培养基加入离心管中（参见配方）。摇动离心管以确保孢子完全悬浮。然后用实验室薄膜包裹管子。
将孢子置于25℃的黑暗中5天（图2）。在黑暗处理后，将孢子置于25℃的红光下以诱导发芽。或者，可以将孢子从黑暗中取出并接种到固体Knop's平板中，然后置于25°C的红光下以诱导发芽（参见食谱）。
注意：＆nbsp;
1. 为了提高发芽率，需要进行暗处理。我们将暗处理的时间从0天优化到5天，我们发现随着暗处理天数的增加，发芽率得到提升（图2）。
2. 红光的波长应在红光范围内，但不应在远红光范围内。远红光治疗会抑制孢子萌发。
图2.黑暗处理会增加孢子萌发率。 *代表显着差异， P < 0.05。当孢子在黑暗中放置5天时，发芽率可以达到25％。
在立体显微镜下观察孢子。经过2天的红光处理后，孢子开始发芽。随着第一次有丝分裂开始，它们变得大而圆，并且具有高密度。（图3A）。在红光处理4-5天后，孢子长出根状茎（图3B）。用根状茎计数孢子来计算发芽率。

图3. Adiantum 孢子的发育。 A. Adiantum 孢子在红光处理2天后开始发芽（箭头线）。 B. Adiantum 孢子在红光处理5天后开始生长根茎（箭头线）。比例尺=100μm。

数据分析

对于实验设计，为了比较两个或更多数据集，我们对每组使用至少三次重复。对于每个重复，我们分析至少12个显微照片，以确保每个显微照片包含30-40个孢子，并且计数的孢子总数达到400个。
为了数据分析，为了计算 Adiantum 孢子的发芽率，我们采用每个固体Knop's板的随机显微照片，其上接种孢子。对于每个显微照片，我们计算孢子的总数和具有根状茎的孢子的数量。每个显微照片的发芽率用下式计算：具有根状茎的孢子数/孢子总数×100％。
对于统计分析，我们使用Excel，Stata和SPSS。为了消除异常值，我们执行Grubbs测试。为了比较两个数据集，我们执行学生的 t - 测试。为了减少误报结果，我们使用Stata执行功率计算。为了比较三个或更多数据集，我们执行单向ANOVA。

食谱

液体knop的中等（1升）

Ca（NO 3 ） 2
0.5克

KNO 3
0.125克

MgSO 4
0.125克

KH 2 PO 4
0.125克

FeCl 3 ·6H 2 O
0.125克

添加1 L H 2 O

使用高压灭菌器在121°C下灭菌15分钟
将液体Knop的介质储存在4°C

实心knop的中等（1 L）

Ca（NO _{3 ）₂}	0.5克
KNO ₃	0.125克
MgSO ₄	0.125克
KH _{2 PO ₄}	0.125克
FeCl _{3· 6H _{2 O}}	0.125克
Gellan Gum	3.0克
添加1 LH _{2 O}

使用高压灭菌器在121°C下灭菌15分钟
将30毫升培养基倒入培养皿中，制成坚实的Knop's plate 将固体Knop's板保存在4°C

致谢

该方案改编自Li et al。（2013）和Cao et al。（2010）中公布的程序。我们要感谢中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供的温室栽培 A. capillus蕨。作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Cao，J.G.，Wang，Q.X.，Dai，X.L。和Duckett，J.G。（2010）。蕨类植物 Adiantum flabellulatum L.卵子发生的超微结构观察（Adiantaceae）。 Am Fern J 100：93-102。
Li，X.，Fang，YH，Yang，J.，Bai，SN和Rao，GY（2013。） Adinatum capillus-veneris 的形态学，解剖学和个体发育概述：研究蕨类植物发育的实验系统。 J Syst Evol 51（5）：499-510。