材料和试剂

带有单个盖子的8条0.2毫升非弯曲平盖PCR管（STARLAB INTERNATIONAL，目录号：I1402-3700）
250毫升和1升汽缸（康宁，目录号：3022P-250,3022P-1L）
预切割特厚纸，7 x 8.4 cm（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703966）
Amersham Protran0.45μm硝酸纤维素膜，300 mm x 4 m（GE Healthcare，目录号：10600002）
5,10和25 ml Costar ® Stripette ®血清移液器（康宁，产品目录号：4487,4488,4489）
50毫升Falcon ®管，聚丙烯（Corning，目录号：352070）
Eppendorf ®管5.0 ml，Eppendorf Quality TM （Eppendorf，目录号：0030119401）
X射线胶片18 x 24厘米双面（科学实验室用品，目录号：MOL7016）
透明醋酸纤维板，例如，彩色复印机透明薄膜（Interaction-Connect，Q-CONNECT ®，目录号：KF00533）
Milli-Q ®水
重组人组蛋白H3.1蛋白，1 mg / ml（New England Biolabs，目录号：M2503S）
注意：准备等分试样（例如，10μl等分试样）并储存在-80°C。
人p300蛋白的重组催化结构域（Enzo Life Sciences，目录号：BML-SE451-0100），100μg，15.18μM（精确浓度可按批次变化，检查试管）
注意：准备等分试样（例如，10μl等分试样）并储存在-80°C。
巴豆酰辅酶A三锂盐~90％纯度HPLC（Sigma-Aldrich，目录号：28007）
注意：对于乙酰化，我们使用：乙酰辅酶A（Sigma-Aldrich，目录号：ACOA-RO ROCHE）。准备5 mM水溶液，等分试样并储存在-80°C。
制造商：Roche Diagnostics，目录号：10101893001。
Trizma ® -hydrochloride，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：T3253）
氯化钾，99.5-101.0％AnalaR NORMAPUR ®（VWR，目录号：26764.298）
UltraPure TM 0.5 M EDTA，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：15575020）
Tween 20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
甘油，≥99％（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
二硫苏糖醇（DTT）（赛默飞世尔科技，目录号：R0861）
氯化镁六水合物，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
硫酸锌七水合物（Sigma-Aldrich，目录号：Z0251）
重组人HDAC1蛋白（Active Motif，目录号：31908）50μg，0.1 mg / ml，1.78μM（精确浓度可能因批次而异，检查试管）
注意：准备等分试样（例如，10μl等分试样）并储存在-80°C。
2x Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610737）
注意：如供应商所述，添加2-巯基乙醇至5％v / v。
2-巯基乙醇，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
丁酸钠，98％（Sigma-Aldrich，目录号：303410）
注意：在水中准备1 M溶液，调节至pH 7并等分。
预制RunBlue 4-12％Bis-Tris（Expedeon，目录号：NBT41227）
20x RunBlue MES运行缓冲区（Expedeon，目录号：NXB70500）
PageRuler TM Prestained protein ladder，10到180 kDa（Thermo Fisher Scientific，目录号：26616）
10x Tris /甘氨酸/ SDS电泳缓冲液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610732EDU）
UltraPure TM Tris缓冲液（赛默飞世尔科技，目录号：15504020）
甘氨酸，≥99.7％AnalaR NORMAPUR ®（VWR，目录号：101196X）
甲醇，≥99.8％AnalaR NORMAPUR ®（VWR，目录号：20847.307）
氯化钠，99.5-100.5％AnalaR NORMAPUR ®（VWR，目录号：27810.295）
牛血清白蛋白，热休克分数pH7≥98％（Sigma-Aldrich，目录号：A9647）
抗巴豆酰 - 组蛋白H3 lys18（H3K18cr）兔多克隆抗体（PTM Biolabs，目录号：PTM-517）
抗兔IgG HRP连接全抗体（GE Healthcare，目录号：NA934-1ML）
增强化学发光（ECL）Western印迹试剂（GE Healthcare，目录号：RPN2106）
合成的巴豆酰化H3K18cr肽95％纯，冻干（TGGKAPR-Lys（巴豆酰）-QLATKAA-EDA-生物素，BioGenes，肽60556.1）（EDA是间隔氨基酸序列）
组蛋白酰化缓冲液（见配方1）
HDAC测定缓冲液（见配方2）
MES运行缓冲区（参见方法3）
Tris甘氨酸SDS（TGS）缓冲液（见配方4）
转移缓冲区（见食谱5）
Tris缓冲盐水，pH 7.5（TBS）（见配方6）
TBS与补间20（TBS-T）（见食谱7）
TBS-T含3％（w / v）牛血清白蛋白（TBS-T BSA）（见配方8）

设备

移液器（Gilson，目录号：F123602，F123601，F123600，F144801，型号：P1000，P200，P20，P2）
移液器控制器PIPETBOY acu2（VWR，INTEGRA Biosciences，目录号：612-2964）
通风橱（例如，Protector Xstream Laboratory Hood，Labconco）
Milli-Q净水系统（默克，目录号：ZRXQ003WW）
GE Healthcare Amersham TM Hypercasette TM 放射自显影盒（GE Healthcare，目录号：RPN11643）
Vortex-genie 2（科学工业，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0236）
微量离心机（STARLAB INTERNATIONAL，型号：Mini Fuge，目录号：N2631-0007）
两个T100 TM 热循环仪（Bio-Rad Laboratories，目录号：1861096）
Amersham电泳电源EPS 301（GE Healthcare，目录号：18113001）
XCell SureLock TM 迷你细胞电泳系统（赛默飞世尔科技，目录号：EI0001）
Transblot ® SD半干电泳转移细胞（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703940）
MI-5 X光胶片处理器（Jet X-Ray，型号：Mi5）
爱普生表情1680扫描仪（精工爱普生，型号：Epson Expression 1680）
注意：也可以使用此处指定的等效设备型号。

软件

ImageJ版本1.50 b
Windows Excel 2016
Adobe Illustrator CC 2015.3
Graphpad Prism 7.0版
爱普生扫描软件专业模式
注意：可能会使用此软件或类似软件的其他版本，但数据分析部分中指定的说明可能会有所不同。

程序

我们发现HDAC的去甲酰化不会发生在合成的，修饰的组蛋白尾肽上，因此需要使用全长重组组蛋白。在我们的测定中，我们首先使用重组组蛋白H3.1和p300的催化结构域（'p300'）在体外对组蛋白进行巴豆酰胺。然后我们使用特异性抗体通过I类HDAC进行去丙酰化，这里针对在赖氨酸18（H3K18cr）下巴豆酰化的组蛋白H3。 H3K18cr是由p300介导的显性组蛋白巴豆酰化（Sabari et al。，2015），并且似乎是从肠细胞分离的组蛋白中最丰富的组蛋白巴豆酰化（Fellows et al。，2018）。重要的是，已经产生了识别H3K18cr的高度特异性抗体（Sabari 等人，，2015）。我们描述了一种用于去甲酰化的测定，以解决三个问题：HDAC1可以去除巴豆酰基团及其需要多少，HDAC抑制剂丁酸盐在防止HDAC1的去甲酰化方面有多高效以及HDAC1对组蛋白去甲酰化的动力学参数是什么？ H3？可以使用相关的酰基-CoA和抗体对其他酰化进行相同的步骤，例如乙酰化，丁酰化或丙酰化。该方案还可用于测试其他HDAC酶，使用相关重组蛋白和其他HDAC抑制剂，如曲古抑菌素A（TSA）和伏立诺他（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）。

第一部分：体外去甲酰化试验

使用p300的催化结构域对重组组蛋白H3.1进行体外巴豆酰化
1. 在冰上解冻所有试剂。
2. 在组蛋白酰化缓冲液中稀释5mM巴豆酰辅酶A原液1:50。
3. 如表1所述，在0.2ml PCR管中制备反应混合物。
  
  表1.组蛋白H3巴豆酰化反应设置
4. 通过移液或短暂涡旋混合均匀。
5. 在30℃下在热循环仪中孵育2小时。
6. 转移至65°C的热循环仪并孵育5分钟以停止反应。
  注意：组蛋白尾巴是非结构化的。因此，热灭活不太可能影响修饰。
7. 将管放在冰上。
HDAC1介导的组蛋白去壬基化试验
1. 用不同浓度的HDAC1进行去壬酰化分析我们验证了HDAC1酶对底物的活性，并证明了观察去甲酰化反应所需的最小量。
  1. 在HDAC测定缓冲液中稀释来自第I部分程序A 1：3的反应，即，46μl反应混合物和92μlHDAC测定缓冲液。
  2. 从8管条上切下3根管，留下5管条。
  3. 将这些PCR管标记为1-5。
  4. 在冰上，如下所述加入稀释的反应混合物，HDAC测定缓冲液和HDAC1，如表2所示。
    注意：这将在管1-4中设置HDAC1的两倍连续稀释，同时保持其他试剂不变。管5是没有任何HDAC1的阴性对照。一旦将HDAC1添加到管1中，尽可能快地执行所有步骤，因为反应将从此点开始。虽然不可能捕获反应的前几秒，因为需要几秒钟的时间来设置它，但重要的是要快速以便记录反应的初始阶段。
    1. 向试管1中加入28μl稀释的反应混合物。
    2. 向试管2-5中加入14μl稀释的反应混合物。
    3. 向管2-5中加入1μlHDAC测定缓冲液以获得HDAC1体积。
    4. 向管1中加入2μlHDAC1并充分混合（0.1 mg / ml，1.78μM原液。终浓度0.12μM）。
    5. 从管1中取出15μl，加入管2中并充分混合。
    6. 从管2中取出15μl，加入管3中并充分混合。
    7. 用管3和4重复，但不用管5.
    表2.使用连续稀释的HDAC1进行反应设置
  5. 通过固定条带的两侧短暂地涡旋所有管。
  6. 短暂地旋转管子将所有液体带到管子的底部。
  7. 在热循环仪中于30°C孵育2小时。
  8. 一旦时间结束，从热循环仪中取出。
    1. 如果要在凝胶上运行样品，加入15μl（等体积）2x Laemmli和5％（v / v）2-巯基乙醇，并在95°C孵育1分钟以停止反应。
    2. 如果要对样品进行斑点印迹，只需在95°C下孵育1分钟即可停止反应。
  9. 此时，管可在-20℃下冷冻至少几天，或继续进行进一步分析，如第II部分所述。
2. 探讨HDAC抑制剂对组蛋白去壬基化的影响这里，丁酸盐以连续稀释的形式引入，其允许测试化合物抑制去丙酰化的能力。这可用于估计将产生的产物量减半所需的抑制剂浓度（IC50）。
  1. 在HDAC分析缓冲液即，46μl反应混合物和92μlHDAC分析缓冲液中稀释来自第I部分A 1：3的反应混合物。
  2. 将8条PCR管标记为1-8。
  3. 在冰上，加入稀释的反应混合物，HDAC分析缓冲液，丁酸盐和HDAC1，如下所述，如表3所示。
    注意：在管1中制备双反应并在管2-6中进行单反应，允许在管1-6中进行丁酸盐的两倍连续稀释，同时保持其他试剂恒定。管7和8是阴性对照，管7没有丁酸盐，管8没有丁酸盐和HDAC1。只要将HDAC1添加到试管1中，就可以尽快执行所有步骤，因为反应将从此时开始。
3. 组蛋白去甾体化动力学参数的测定
  确定动力学参数（如最大初始速率）可以评估酶是否遵循Michaelis-Menten动力学，并且是找出重要动力学参数的有用方法，例如K cat ，V max < / sub>和K m 。它允许比较酶与不同底物的活性或比较不同酶与相同底物的活性。这需要随时间绘制底物或产物浓度的变化，以便可以确定初始速率（参见图1用于说明）。必须优化酶的浓度，以使初始速率在可测量的时间范围内。然后将初始速率相对于反应开始时的底物浓度作图，以确定最大速率（V max ）和底物浓度在半V max （K _{m ）如图1所示。由于此处进行的反应是通过基于抗体的方法分析的，因此无法实时测量。因此，有必要为每个时间点建立反应。在此，建立六个相同的反应并在0,0.5,1,2,4和10分钟停止。我们提出的方法实用的最短时间点是30秒。为了可靠地确定动力学参数，还需要对每种底物浓度进行三次反应，并且推荐五种不同的底物浓度。这意味着需要90个反应（5个底物浓度×6个时间点×3个重复）。这些被分为三个重复的集合，分别命名为A，B和C.在我们的手中，如下所述，初始反应发生在第一分钟。减少酶的量可以允许更长的反应时间并因此在初始阶段期间有更多的时间点。但是，必须平衡这一点，以防止所有反应的底物浓度变化与背景噪音区别开来。
  
  图1.酶动力学图。左图显示了测定的输出，它给出了底物浓度随时间的变化。通过发现反应的第一部分的梯度是线性的，由此确定初始速率。在右图中，绘制了所有测试的底物浓度的初始速率，以得到双曲线的Michaelis-Menten曲线。这允许确定动力学参数V max 和K m 。
  
  如第I部分程序A中所述的Crotonylate H3.1。为了制备足够的巴豆酰化H3进行90次分析，如表4所述，使用更多的每种成分使总体积达到230μl。
  
  表4.组蛋白H3巴豆酰化反应设置，体积更大
  
  在热循环仪中于30°C孵育2小时。
  
  将管转移到65°C的另一个热循环仪中并孵育5分钟以停止反应。
  
  将管放在冰上。
  
  在冰上，在HDAC测定缓冲液中稀释反应混合物，得到巴豆酰化组蛋白H3的1：4,1：6,1：8,1：10和1:12稀释液。
  注意：表5描述了在使用最少量的起始反应混合物的同时如何连续进行此操作。但是，如果需要，可以以不同的方式完成。对于以下步骤，每次稀释的巴豆酰化组蛋白H3需要至少260μl。
  
  表5.巴豆酰基-H3反应混合物的不同稀释液的制备
  
  准备三个5条管，编号为0分钟，标记为1：4,1：6,1：8,1：10和1:12（图2A，2B或2C的第一行为蓝色）。
  
  准备另外15个5条管，编号为0.5,1,2,4或10（分钟），标记为1：4,1：6,1：8,1：10和1:12（图2中的以下五行）红色）。
  
  在冰上，向每一个中加入14μl的1：4,1：6,1：8,1：10或1:12稀释的反应混合物。将管保持在冰上直至加入HDAC1。
  
  对于标记为0分钟的一条反应（在图2中为蓝色），加入1μlHDAC测定缓冲液。
  
  通过握住条带的两侧短暂地涡旋。
  注意：如果管子的侧面或盖子上有气泡或液体，可以将管子旋转或液体轻轻敲打到底部。
  
  立即在热循环仪中于30°C孵育1分钟。
  注意：如果HDAC1添加到反应中它不会是零时间，但会运行几秒钟直到反应停止。但是，需要阴性对照来提供基线水平。为了确保在没有酶的情况下没有观察到底物浓度的变化，我们在没有HDAC1的情况下孵育了2小时的反应并且没有看到巴豆酰化H3的减少。因此，选择1分钟，因为这很容易执行。
  
  转移至95°C的热循环仪1分钟。
  
  重复步骤B3f至B3i，另外两个管标记为0分钟。
  
  在HDAC分析缓冲液中稀释HDAC1原液1：4，即，20μlHDAC1和60μlHDAC分析缓冲液。
  
  在标记0.5分钟的一个反应条带中的每个管中（在图2中以红色表示），加入1μl稀释的HDAC1（最终浓度为0.03μM）。
  
  如果需要，通过固定条带的两侧短暂旋转并短暂旋转或轻拍液体。
  
  立即在设定为30°C的热循环仪中孵育30秒。
  注意：添加HDAC和涡旋大约需要20-30秒。如果需要时间点短于30秒，减少酶的量而不是缩短反应时间，因为这些不准确。
  将带材在95°C下转移至热循环仪1分钟以停止反应。
  
  用其他0.5分钟的条带重复步骤B3l-B3o，然后分阶段用1,2,4和10分钟的条带，相应地改变30℃的孵育。
  注意：有必要分阶段启动反应，以便时间点可以准确。
  
  组织试管，使您有一组标记为A，B和C的反应。可以在此时冷冻试管或继续进行第II部分程序B所述的实验。
  
  图2.反应的设定。显示所有90个反应的设置，组织成反应混合物的重复数量，时间和稀释度。}

第二部分：使用基于抗体的方法揭示去甲酰化结果

蛋白质印迹
蛋白质印迹适用于具有少量个体反应的测定，并提供明确的分子量限定条带，显示反应如何进行。
1. 打开预制的SDS-PAGE凝胶，用Milli-Q水冲洗孔，冲洗孔中保存的溶液和气泡。
2. 将凝胶装配在电泳槽中，在内室中加入200ml 1x MES缓冲液，并用1x MES缓冲液将外室半满。
  注意：确保内罐没有泄漏。如果水箱中只有一个凝胶，请使用缓冲坝。每次在内腔中MES缓冲液应该是新鲜的，但在外腔中可以使用多达三次。将水箱放在冰上可以提高运行质量。
3. 在预制SDS-PAGE凝胶的第一个孔中加载5μl预先染色的蛋白质标记物。
4. 在随后的孔中加载8μl每种样品。
5. 在100-150V，250mA下运行1-1.5小时，直到蓝色染料前端到达凝胶底部和/或标记的不同大小的条带分离。
6. 用1x TGS缓冲液短暂冲洗凝胶，切掉凝胶顶部的孔。
7. 将吸墨纸浸泡在转移缓冲液中，放在半干转移机上。
8. 在转印缓冲液中浸泡一块与吸墨纸相同大小的硝酸纤维素膜，并在吸墨纸上浸泡一层，注意不要在各层之间引入气泡。
9. 将凝胶层叠在堆叠顶部，将标记定位成使其平行于膜的垂直侧，使得显示样品到达距离的蓝线位于膜上方。
  注意：再次注意不要在层之间引入气泡。
10. 修剪凝胶，使其与膜的大小相同。
  注意：当运行许多凝胶时，切割膜的角落或角落以区分它们是有用的。不建议使用笔，因为它会运行。
11. 将另一张浸泡在转移缓冲液中的吸墨纸放在上面。
12. 将一个圆形管（例如10ml移液管）从堆叠顶部的一侧牢固地滚到另一侧，以除去任何残留的气泡。
13. 在15 V，270 mA下将蛋白质转移到膜上45分钟。
  注意：当传输机器中有两个或三个堆栈时，建议使用一小时。
14. 将膜置于50ml Falcon管中，用TBS-T冲洗膜几秒钟。
15. 加入15 ml TBS-T BSA封闭，在室温下温和搅拌孵育1小时。
16. 在5ml Eppendorf管中，在TBS-T BSA中以1：2,000至1：5,000稀释度（取决于抗体的批号）制备5ml抗H3K18巴豆酰抗体溶液。
17. 将用过的TBS-T BSA溶液倒入另一根管中，该管应储存在4°C以备后用，并将一抗溶液加入含膜管中。
18. 在4°C孵育过夜，轻轻搅拌（摇动或滚动）。
19. 用10ml TBS-T短暂洗涤三次（5-10秒）。
20. 用15ml TBS-T洗涤两次，每次15分钟并轻轻搅拌。
21. 用15 ml TBS-T BSA洗涤一次，每次15分钟。
  注意：前一天的TBS-T BSA可以重复使用。
22. 在5ml Eppendorf管中，在TBS-T BSA中以1：10,000稀释度制备5ml抗兔抗体与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的溶液。
23. 弃去TBS-T BSA，在室温下孵育抗兔抗体1小时。
24. 用10 ml TBS-T短暂洗涤三次（5-10秒），然后用15 ml TBS-T洗涤三次，每次15分钟。
25. 从falcon管上取下膜，放在一个干净，平坦的表面上，例如，在一个大型称重船上。
26. 移取1 ml ECL化学发光底物（A和B比例为1：1），确保所有膜都被覆盖并离开1分钟。
27. 通过用纸巾接触膜的边缘并放置在显影盒中的透明醋酸纤维素（或一些其他透明片）上来擦掉多余的ECL。
28. 在顶部涂上另一层醋酸纤维板，注意不要引入气泡。
29. 用胶带密封边缘，盖上盖子，避免将薄膜暴露在光线下。
30. 在黑暗的房间里，根据信号，将X光胶片放在膜上15秒至5分钟。
31. 将曝光的胶片放入自动显影器中，等待它从另一侧出来。
注意：
1. 抗体之间可能存在批次之间的差异，因此优良作法是验证抗H3K18cr抗体（或使用的任何抗酰基抗体）的特异性，例如，使用肽点印迹。
2. 虽然我们还没有测试过其他图像捕捉系统作为ECL / X射线胶片设置的替代品，但是这种可以捕获化学发光的系统可能不仅实用，而且可能比使用x-更好。射线电影。
斑点印迹
当需要分析多个反应（超过15个）时，斑点印迹比Western印迹更合适。它允许将所有反应放在单个膜上，以便可以直接比较它们的点强度。必须一式四份地发现反应，以允许移液或溶液在膜上扩散的变化。该协议按照第I部分程序B3的要求进行描述。
1. 为A，B和C组反应中的每一组切下一块硝酸纤维素膜。
  注意：剪下你认为需要的稍大的一块并稍后修剪它。一旦修剪过的10 x 12点网格的典型尺寸为5.5 x 7.5厘米。
2. 使用P2微量移液管以网格形式一式四份移取2μl反应，如图3所示。
  注意：保持移液器稳定并以均匀的速率分配液体，以减少斑点的变化。使用铅笔标记网格，以便您可以将斑点排成一行。通过使用Bio-Rad的Bio-dot 等基于真空的斑点印迹设备，可以提高斑点的一致性和速度。但是，我们还没有测试过这样的设备。
  
  图3.用于斑点印迹分析的硝酸纤维素膜上的反应点的布局。以这种有序的方式放置斑点使得后期的量化更容易。
3. 让斑点完全干燥。这需要5-10分钟。
4. 在转移缓冲液中短暂冲洗，然后用TBS-T冲洗。
5. 继续步骤A15的Western印迹方案（第II部分程序A），阻断膜。
  注意：使用更大量的抗体可能是有用的，因为这些斑点印迹的膜片更大。一抗和二抗均推荐10至15毫升。对于猎鹰管而言，膜片可能太大，因此可以使用适当尺寸的托盘。

数据分析

量化每个点或乐队
1. 使用Epson扫描仪及其软件将胶片扫描到计算机。选择以下参数：正片，8位灰度和400 dpi。扫描并将其保存为TIFF文件，包括文件名中的日期，实验和曝光时间。
2. 为每个基质浓度选择合适的曝光时间，其中斑点不要太暗或过度曝光。
  注意：如果斑点过于模糊，则很难区分背景。如果斑点过度曝光（饱和度），则达到该区域可能的最大强度，并且不会观察到斑点之间的差异。可以为每种基质浓度选择不同的曝光时间，以便为每种基质选择最合适的曝光。
3. 在适合的程序（如Adobe Illustrator或Photoshop）中，添加一个黑色方块和一个白色方块。将其另存为TIFF文件。
  注意：当ImageJ给出图像选择的定量峰值时，无论此峰值在其他选择中是否为高，它都会显示窗口顶部的最高峰值。当它们不能一起选择时（例如，当斑点太多时），这使得斑点之间的比较变得困难。为了避免这个问题，包括黑色区域，其给出最大可能值，并且包括白色区域，其给出最小可能值。这意味着所有值都与此相关，并且可以比较不同的选择。
4. 在ImageJ中打开图像。
5. 使用矩形工具选择一个斑点区域，包括白色和黑色区域。
6. 在“分析”选项卡的“凝胶”部分下，选择“选择第一道”（快捷键：Ctrl + 1），如图4所示。
  
  图4.使用ImageJ软件确定光斑强度。在ImageJ中打开图像后，可以使用矩形工具（蓝色框）选择水平条带。绘制此选择后，可以使用线条工具（紫色框）选择对应于不同点的各个峰。然后使用棒工具（绿色框）在结果选项卡中显示所选峰的值。在上图中，已选择前两个峰值，第三个峰值已使用棒工具突出显示，第六个峰值正在使用线条工具选择（这些是组合屏幕截图，可同时显示多个操作）。
7. 在同一部分中，选择“情节车道”（快捷键：Ctrl + 3）。
8. 双击线条工具并在窗口中键入合适的值以将其设置为适当的宽度，然后选择与点或带相对应的峰值。
  注意：该值仅在您键入数字时更改，而不是在您按Enter键时更改。尝试几个宽度找到一个适合峰值的宽度，然后将其用于所有选定的峰值。值50到60（没有给出单位）通常适合一个点的峰值，一个带子的峰值为70到100。如果选择位于错误的位置，则可以使用Control / command-Z来删除选择。
9. 使用相同的宽度设置，选择一个没有峰值的区域，该区域对应于背景。
10. 使用棒工具，依次单击每个峰面积，值将出现在结果窗口中。
11. 选择这些，将值复制并粘贴到Excel中。
12. 根据膜上的位置，为每个值定义反应名称。
13. 对其他行重复步骤5到12。
  注意：跟踪分析斑点的顺序，并记住每个反应有四个重复，分为两行。
在Excel中计算每种底物浓度的初始反应速率这仅适用于测量多个时间点和底物浓度的第I部分B3。
1. 按背景值减去每个点的值。
2. 计算每个反应的四个点的平均值。
3. 计算每个时间点相对于零时间点的值。
  注意：对于每次稀释的底物，将每个时间点除以零时间点，使零时间为1，其他值与此相关。
4. 将底物稀释液转换为μM的巴豆酰基-H3。这假设在第一反应中5.65μM的H3.1在赖氨酸18处完全巴豆酰化，已经在图5中测试过。
  注意：
  1. 将每个相对值乘以反应混合物中修饰组蛋白的浓度，如表6所示，将斑点强度转换为底物浓度。
  2. 我们假设这是因为我们还发现了0.45到45μM的合成巴豆酰化H3K18cr肽（K18位置周围的一小段氨基酸），并发现5.65μM巴豆酰化H3的制备强度在4.5到9之间μM巴豆酰肽如图5所示。将肽在HDAC测定缓冲液中稀释。
  图5.通过斑点印迹比较巴豆酰化组蛋白H3和H3K18cr巴豆酰肽的ECL强度。 H3K18cr肽序列为TGGKAPR-Lys（巴豆酰）-QLATKAA-EDA-Btn，EDA为间隔区和Btn表示C末端生物素化。 5.65μMBotononyl-H3的斑点强度对应于巴豆酰肽在4.5和9μM之间的强度。
  
  表6.将巴豆酰基-H3反应混合物的稀释液转化为浓度
5. 绘制每种巴豆酰化组蛋白浓度的底物浓度随时间的变化，如图6所示。
  
  图6.通过绘制底物浓度与时间的关系来确定初始速率。绘制每个时间点的底物浓度并重复可以让我们看到反应如何进展。在第一个图（上图）中，反应在第一分钟内最快，因此只有这些时间点在第二个图（下图）中绘制，现在显示线性关系并允许初始速率（线的梯度））待定。三个重复：A，B和C.
6. 确定反应初始速度开始减慢前的持续时间，并为这些点拟合线性回归线。
  注意：在图6所示的反应组中，初始速率发生在反应的前30秒至第1分钟。选择最接近数据点的匹配项。
7. 取A，B和C重复的每一行的梯度，这给出了速率。
8. 重复其他底物浓度。
9. 根据速率创建基质浓度表并转移到GraphPad Prism。
使用GraphPad Prism版本7计算动力学常数
1. 绘制初始反应速率与底物浓度的关系。
2. 在分析部分，选择非线性回归。
3. 选择酶动力学 - 底物与速度，选择Michaelis-Menten并单击“确定”。
4. 这将为您提供V max ，即当所有活性位点被占用时该酶浓度的最大初始速率。它还会给你K m ，即达到最大速率一半所需的底物浓度。
5. 再次选择酶动力学 - 底物与速度部分，但这次选择K cat 。在约束选项卡中，通过参数名称'Et'，约束'常数等于'并输入使用的酶浓度到值框中，在我们的例子中，这是0.03，对应于使用的0.03μM的HDAC1。
  注意：这种分析的一个例子显示在Fellows等人的图7b中。（2018），描述了HDAC1去丙酰化和去乙酰化的比较动力学分析。＆nbsp;

食谱

组蛋白酰化缓冲液
50mM Tris-HCl pH 8
50 mM KCl
0.1 mM EDTA
0.01％吐温20
10％甘油
1 mM DTT
分装并储存在-20°C直至使用
HDAC分析缓冲液
25mM Tris-HCl pH 7.5
50 mM KCl
1 mM MgCl 2
1μMZnSO 4
分装并储存在-20°C直至使用
1x MES缓冲区
50毫升20x RunBlue MES缓冲液
950毫升蒸馏水或Milli-Q水
1x TGS缓冲区
100ml 10x Tris /甘氨酸/ SDS电泳缓冲液（Bio-Rad）
900毫升蒸馏水或Milli-Q水
转移缓冲液（1 L缓冲液的配方）
5.8克Tris
2.9克甘氨酸
200毫升甲醇
800毫升蒸馏水或Milli-Q水
Tris缓冲盐水（TBS）
302.5克Tris
438.0克NaCl
1升蒸馏水或Milli-Q水
TBS与补间20（TBS-T）
在1L TBS中加入2.5ml 20％吐温20
TBS-T含3％（w / v）牛血清白蛋白（TBS-T BSA）
将6克BSA溶于200毫升TBS-T中，并在4℃下储存

致谢

这项工作得到了MRC DTP学生对RF，BBSRC和MRC资助PVW的支持。我们感谢TabithaRücker和Karolina Doubkova对手稿的批判性阅读。作者宣称没有利益冲突。这是一个基于Fellows et al。（2018）发表的着作的详细方法。

参考

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