材料和试剂

50毫升离心管（康宁，目录号：430828）
棉球（Winner Medical Group，目录号：50401050）
无菌纱布（Winner Medical Group，目录号：016935）
缝合针（宁波医用针有限公司，7/0）
显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
显微镜盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-544-18）
滴管（上海百千生物技术，目录号：J00082）
小鼠（上海SLAC，菌株：C57BL / 6J）
重蒸水（ddH 2 O）
75％酒精（国药化学试剂，目录号：80176960）
矿物油（Sigma-Aldrich，目录号：M8410）
霍乱毒素B（CTB），Alexa Fluor TM 555结合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：C22843）
异氟烷（RWD生命科学，目录号：R510-22）
Iodophor（上海利康消毒高科技，目录号：310100）
利多卡因（MP Biomedicals，目录号：190111）
蔗糖（AMRESCO，目录号：M117）
多聚甲醛（PFA）（西格玛奥德里奇，目录号：16005）
最佳切削温度化合物（O.C.T）（Sakura，Tissue-Tek ®，目录号：4583）
二脒基 - 苯基 - 吲哚（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
AQUA-Mount TM 安装介质（赛默飞世尔科技，目录号：13800）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钠二水合物（Na 2 HPO 4 ·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：71645）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S5886）
氨苄西林（INALCO，目录号：1758-9314）
三氯乙醛水合物（国药化学试剂，目录号：30037517）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S5011）
Tris（Sangon Biotech，目录号：A100826）
盐酸三（Tris-HCl）（AMRESCO，目录号：T0234）
Triton X-100（AMRESCO，目录号：0694）
DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
0.1 M磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）（见食谱）
氨苄青霉素溶液（见食谱）
0.9％氯化钠溶液（见食谱）
1％利多卡因溶液（见食谱）
10％水合氯醛溶液（见食谱）
0.2 M磷酸盐缓冲液（PB）（见食谱）
0.05M Tris缓冲盐水（TBS）（见食谱）
0.5％/ 0.05％Triton溶液（见食谱）
CTB解决方案（见食谱）
4％多聚甲醛溶液（见食谱）
30％蔗糖溶液（见食谱）
DAPI解决方案（见食谱）

设备

Nanoliter 2010玻璃毛细管（本手稿中称为移液器）（World Precision Instruments，目录号：504949）
剪刀（RWD生命科学，目录号：S12003-09）
镊子（VETUS，目录号：ST-10）
眼科剪刀（World Precision Instruments，目录号：14003-G）
水浴（景洪实验设备，型号：XMID-8222）
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector（Drummond Scientific，型号：Nanoject II，目录号：6584）
直流温度控制器（FHC，型号：40-90-8D）
麻醉机（RWD生命科学，目录号：R610）
火焰/棕色微量移液器拉拔器（Sutter Instrument，型号：P-97）
剃须刀（Codos，目录号：KP-3000）
荧光显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse Ni-U）
-80°C冰箱（Thermo Fisher Scientific，目录号：ULT 1386-3-V42）
冷冻切片机（Leica Biosystems，型号：Leica CM1950）

软件

ImageJ（美国国立卫生研究院）
Matlab（Mathworks公司，美国）

程序

在20:00将一只雄性小鼠和两只雌性小鼠放入家笼中。第二天上午8点检测阴道塞的存在。如果雌性小鼠具有阴道栓，则胚胎期表示0.5天（E0.5）。否则，将雄性和雌性小鼠分成两个家笼，并在20:00再次将它们放入一个家笼中。
在高温（121°C）和高压（0.12 MPa）的站点对所有金属手术器械进行灭菌30分钟。用75％乙醇消毒其他非金属设备。
将PBS和氨苄青霉素溶液分别装入两个离心管中。将管保持在45°C的水浴中。
使用微量移液器拉出器拉动移液器。用剪刀打破移液器吸头使其打开。用移液管填充矿物油，然后将其装入Nanoject II中。使用Nanoject II将CTB-555吸入移液管中。
注意：移液器吸头的直径约为50μm。
在室内用氧气中的1.5％异氟烷麻醉怀孕的小鼠，直到其呼吸频率降低到每分钟60次，然后将其转移到32°C的加热垫上，由DC温度控制器控制。
将怀孕老鼠的头部放入面罩中，确保小鼠连续用氧气中的0.5-1％异氟烷麻醉，直至呼吸频率保持在每分钟80-100次之间。
刮除小鼠腹部并使用含75％乙醇和碘伏的棉球连续消毒。
用无菌纱布盖住小鼠腹部，切开2厘米长的切口以露出腹部切口的位置。
从腹部到腹部，从腹部中间小心地切开腹部皮肤和腹膜。
注意：腹部精确中部的切口可以避免毛细血管。否则，受损的毛细血管引起的出血更容易引起伤口感染。
用镊子小心地拉出胚胎，然后将它们放在腹部干燥的无菌纱布上。
注意：张力应轻微，以免撕裂子宫壁。小心不要损坏血管和胎盘。
使用眼科剪刀（视频1）在胚胎眼球上方的子宫壁上切开一条狭缝（~1 mm）（约1 mm）。
注意：如果胚胎眼球上的子宫壁上有血管，用手轻轻旋转胚胎以避免血管。

视频1
一只手拿着胚胎。另一只手拿着Nanoject II。移液器通过子宫壁，眼睛滑动，巩膜切开，然后将其塞入玻璃体腔。将1μlCTB-555注射到一只眼睛的玻璃体腔内，每次69 nl，间隔1-2秒（视频1）。
注意：
1. 一个毫米长的移液管尖端在视网膜下插入。注射后，移液器在眼睛中停留5秒钟。
2. 第二个人使用滴管将温热的PBS添加到子宫壁表面，以使其在整个过程中保持湿润。
3. 将实验者的手臂放在桌子上有助于防止注射过程中的干扰。
以相似的体积和速度连续注射其他胚胎的眼睛。
用镊子小心地将胚胎换成腹部。
用1ml氨苄青霉素溶液填充怀孕小鼠的腹腔，以防止感染。在腹部用纱布吸收额外的溶液。
从内到外缝合腹膜和腹部皮肤。
在伤口上涂抹1％利多卡因溶液以缓解疼痛。
用0.5-1％异氟醚连续麻醉孕鼠10小时。
注意：怀孕的老鼠被麻醉，使手术过程顺利。
10小时后，用10％水合氯醛溶液麻醉怀孕小鼠，剂量为0.06ml / 10g体重。
注意：注射水合氯醛溶液后怀孕的小鼠仍有心跳，以避免胎儿缺氧。
再次打开腹部露出胚胎。用剪刀在子宫壁上切开。切断脐带取出胚胎。
将胚胎固定在板上并使用4％PFA溶液进行心脏灌注。
注意：经心脏灌注胚胎的过程与成人相似。最好在原子显微镜下进行心脏灌注以显示心脏的结构。
取出胚胎大脑，用4％PFA固定12-18小时。
注意：取出胚胎的视网膜并在4％PFA中固定2小时。将视网膜安装在载玻片上并用荧光显微镜观察。有必要确保大多数视网膜神经节细胞都被CTB-555标记。
用30％蔗糖脱水大脑。
将它们沉入30％蔗糖溶液中后，将其嵌入O.C.T中，然后迅速转移到-80°C冰箱中。半小时后，将大脑放入冷冻切片机中，恢复20分钟。
将大脑切成20微米厚的冠状切片。使用TBS溶液清洗脑切片5次（每次5分钟）以除去O.C.T.
注意：收集LGN和SC部分的所有脑片。
用DAPI染色脑切片（见配方12）7分钟，然后用TBS溶液洗涤5次（每次多长时间）。
在显微镜幻灯片上装载脑切片。将切片介质涂在切片上，直到切片在空气中干燥，没有光照。最后，盖玻片安装在切片上。
在荧光显微镜下拍摄脑切片（图1）。胚胎玻璃体腔注射的结果也可以在网上找到：
https://academic.oup.com/cercor/article/28/4 / 1168/3064954 。

图1.在E18.5胚胎玻璃体内注射后用CTB-555标记的LGN图像。背侧LGN用白色虚线勾勒出来。

数据分析

视网膜投射的分析如前所述（来自我们的实验室）进行（Diao et al。，2018）。简而言之，在ImageJ（NIH，USA）中减去所有图像的背景。使用Matlab（Mathworks Inc，USA）进行荧光标记区域的定量，例如对侧投影的分数和LGN和SC的大小。对于20μm脑切片，在计算对侧投影的分数时应用30％的阈值（像素的荧光强度高于最大强度的30％）。 CTB-555和DAPI荧光信号有助于概述LGN和SC的领土。
注意：胚胎的出生年龄可能相差±0.5天。有必要使用足够数量的怀孕雌性来获得足够的胚胎进行分析。

食谱

0.1M磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）
0.02 M KH 2 PO 4 ，0.04 M Na 2 HPO 4 ·2H 2 ddH 2 O中的O和0.1567 M NaCl
氨苄西林溶液
在0.1M PBS中0.1mg / ml氨苄青霉素
0.9％氯化钠溶液
ddH 2 O中的0.9％NaCl
1％利多卡因溶液
1％利多卡因在0.9％NaCl溶液中
注意：在溶液中加入少许盐酸以帮助溶解。
10％水合氯醛溶液
10％水合氯醛在0.9％NaCl溶液中
0.2 M磷酸盐缓冲液（PB）
0.04 M NaH 2 PO 4 和0.2 M Na 2 HPO 4 ·2H 2 d在ddH 2 O
0.05M Tris缓冲盐水（TBS）
0.0123 M Tris，0.0377 M Tris-HCl，0.1538 M NaCl，ddH 2 O
0.5％/ 0.05％Triton溶液
TBS中0.5％/ 0.05％Triton X-100
CTB解决方案
用10μl二甲基亚砜（DMSO）溶解500μgCTB固体粉末，然后加入230μl0.9％氯化钠溶液
4％多聚甲醛溶液
PB中4％PFA
30％蔗糖溶液
PB中含30％蔗糖
DAPI解决方案
ddH 2 O中1 mg / ml DAPI用于储存
1：3,000稀释在TBS中以达到工作浓度

致谢

作者声明没有竞争利益。该方案改编自Diao 等人（2018）。我们感谢以下资助机构支持这项工作：中国NSF（31421091和31422025），青年1000计划和中华人民共和国科学技术部（2015AA020512）。

参考

Diao，Y.，Cui，L.，Chen，Y.，Burbridge，T.J.，Han，W.，Wirth，B.，Sestan，N.，Crair，M。C. and Zhang，J。（2018）。皮质和丘脑之间的相互关联有助于视网膜轴突靶向背外侧膝状体核。 Cereb Cortex 28（4）：1168-1182。