材料和试剂

4％次氯酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：239305）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Mediatech，Cellgro ，目录号：21-031）
KCl
NaCl
KH ₂ PO ₄
Na HPO ₄
EDTA
DTT
抑肽酶（USB，目录号：9087-70-1）
亮抑酶肽（MP，目录号：195623）
胃酶抑素（MP，目录号：195368）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：329-98-5）
乙醇
0.04％次氯酸钠（参见配方）
100x蛋白酶抑制剂（储存在-20°C）（参见配方）
解决方案B（参见配方）
1x裂解缓冲液（见配方）

设备

小鼠的CO 2腔室
解剖剪刀（一种中型和一种小型解剖小鼠）
镊子（2）
15毫升锥形管
1.5 ml eppendorf管
3ml胰岛素注射器
涡流
离心机兼容15-ml锥形

程序

确保在开始杀死老鼠之前至少1小时准备所有包括PBS的溶液，并将其存储在冰上，以便在开始使用它们时感冒。
根据美国兽医协会（AVMA）关于Euthanasia的指南，通过CO 2窒息牺牲小鼠（18-25克）（https://www.avma.org/KB/Policies/Documents /euthanasia.pdf）。简言之，通过将啮齿动物暴露于缓慢升高的二氧化碳浓度直到它们变得无意识，来使用第一二氧化碳的麻醉特性。腔室填充率为20％，或每分钟笼体积的1/5 推荐的。在约1分钟后出现较慢的，未协调的运动，在约2分钟后动物停止移动，并且在约2.5分钟后出现无意识。在实现无意识之后，可以增加流量以加速死亡。两步安乐死用于确保死亡。一旦动物已经失去意识并且对脚趾捏力不响应，则使用随访方法。这可以包括使用锋利的剪刀，颈椎脱位或胸廓切开术进行头晕
打开腹部，通过在胃上轻轻地拉动并移除肠系膜（腹膜折叠在肠道周围，将肠道连接到背腹壁，将胃肠道从胃分离到肛门），其包含脂肪，血管和淋巴节点）。
将肠切成感兴趣的部分（空肠，回肠和大肠）
将这些碎片放在冰上的冷PBS中，一次处理一次。
用冷PBS将肠内容物冲洗至3 m，用胰岛素注射器清洗。或者，将玻璃棒上的肠倒置，并在冷PBS中旋转
在冷PBS中清洗肠道碎片并保存，直到您完成所有的碎片（同步您的工作）。
孵育片在50-100毫升的0.04％次氯酸钠冰上15分钟（这使用小烧杯很好）。此步骤可去除细菌污染物。
在此期间，为每个组织片准备三个15-ml锥形管，并在每个管中放入5-10ml溶液B（如果使用玻璃棒，则需要10ml）。标记管子，将它们留在冰上。
从次氯酸钠中取出肠片，在PBS中冲洗
将肠片在15ml含有锥形的溶液B中在冰上15分钟
取出溶液B，加入5ml PBS（或溶液B）。我这样做是通过用长镊子握住肠段，倾析溶液B，然后加回肠段并加入PBS。
涡旋15秒。
取肠片，并用溶液B将它们放入另一个15 ml锥形瓶中
重复步骤11-14两次（每件3个试管）。
从每个管的所有管悬浮细胞，并将它们混合在一个管
以1,000rpm（1,000×g/min，4℃，10分钟）离心
取出液体并将细胞悬浮在裂解缓冲液（对于空肠和Ileum为5ml或对于结肠为1ml）中用于全细胞裂解物或将Trizol（Invitrogen）用于RNA提取1ml。

食谱

0.04％次氯酸钠
1ml 4％次氯酸钠
99 ml PBS
解决方案B
2.7mM KCl 0.2g或2.7ml 1M KCl
150mM NaCl 8.77g 50ml 3MNaCl溶液
1.2mM KH 2 PO 4 0.16g
680mM Na 2 HPO 4 9.65g
1.5mM EDTA 0.44g 3ml 0.5M EDTA溶液
0.5mM DTT 0.08g 1ml 0.5M DTT（加入新鲜）
在ddH <2> O中加入1 L
100x蛋白酶抑制剂（-20℃保存）
10mg抑肽酶
10mg亮肽素 10mg胃蛋白酶
174.2mg PMSF
在无水乙醇中达到10ml 在使用
之前充分涡旋
1x裂解缓冲液
5x报告裂解缓冲液 2 ml
ddH ₂ O 7.9 ml
100x蛋白酶抑制剂 100μl

致谢

该方案由Kulkarni和Yielding（1985）报道的隐窝分离程序修改。这项工作得到国家癌症研究所的RO1 CA10922和P20s RR15563和RR016475的支持。

参考文献

Kulkarni，M.S.and Yielding，K.L。（1985）。 DNA损伤并在上皮（粘液）细胞和孤立结肠的隐窝细胞中修复。 Chem Biol Interact 52（3）：311-318。
Zeineldin，M.，Cunningham，J.，McGuinness，W.，Alltizer，P.，Cowley，B.，Blanchat，B.，Xu，W.，Pinson，D.and Neufeld，K.L。敲入小鼠模型揭示了核Apc在细胞增殖，Wnt信号抑制和肿瘤抑制中的作用。 Oncogene 31（19）：2423-2437。