第一部分：循环测定

材料和试剂

塑料尖端10（Thermo Fisher Scientific，Molecular Bioproducts，目录号：3511-05）
塑料吸头1,000（Thermo Fisher Scientific，Molecular Bioproducts，目录号：3101）
塑料尖端200（Thermo Fisher Scientific，Molecular Bioproducts，目录号：3551）
1.5 ml Microcentrifuge试管（USA Scientific，目录号：1415-2508）
2.0毫升MCT刻度管（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：05-408-146）
96孔Microfluor 1White平底板（赛默飞世尔科技，目录号：7705）
Combitips Advanced 10 ml（Eppendorf，目录号：0030089464）
一次性细胞提升器（Fisher Scientific，Fisherbrand，目录号：08-100-240）
感兴趣的细胞：任何细胞都可用于测量NAD + / NADH水平
感兴趣的组织：任何组织都可用于测量NAD + / NADH水平
三氯乙酸（TCA）（西格玛奥德里奇，目录号：T4885-500G）
氢氧化钠（NaOH）10N（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：SS267）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134）
Bio-Rad蛋白质分析染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
1,2,2-三氯三氟乙烷（TCTFE）（Fisher Scientific，Fisher Chemical，目录号：T1781）
三辛胺（Sigma-Aldrich，目录号：T81000-500G）
Tris base，Trizma base（Sigma-Aldrich，目录号：T6066）
Diaphorase（Sigma-Aldrich，目录号：D5540-500UN）
酒精脱氢酶（ADH）（西格玛奥德里奇，目录号：A3263-75KU）
活性炭（Sigma-Aldrich，目录号：C7606-125G）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S0751-500G）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Sigma-Aldrich，目录号：S0876-500G）
绝对乙醇（Fisher Scientific，Fisher BioReagents TM ，目录号：BP2818-500）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
β-NAD钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：N0632-1G）
核黄素5'-单磷酸钠盐水合物（FMN）（西格玛奥德里奇，目录号：F8399）
刃天青钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：199303-5G）
磷酸盐缓冲盐水（PBS - pH 7.4）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10010023）
有机溶剂（见食谱）
磷酸钠缓冲液（pH 8.0）（见食谱）
20 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）（见食谱）
4％木炭悬浮液（20 mM磷酸钠，pH 7.0）（见食谱）
Bradford Dye（见食谱）
Tris缓冲液（1M，pH 8.0）（见食谱）

设备

注意：所示的品牌和型号是我们集团使用的品牌和型号，也可以使用类似的设备。

1升容量瓶
移液器（10,200,1,000μl）
重复移液器（Eppendorf，型号：Repeater ® M4）
剪刀
均质器，Tissue Tearor（Bio Spec Products，目录号：780CL-04）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
规模（Mettler-Toledo International，型号：AG104）
Sonic Dismembrator（Fisher Scientific，型号：Model 100）
Vortex（科学工业，型号：Vortex-Genie 2，目录号：G560）
-80°C冰柜
读板器（Molecular Devices，型号：SpectraMax ® Gemini TM XPS）
分光光度计（BioTek Instruments，型号：Epoch 2）

软件

Gen5微孔板读板机和成像仪软件（BioTek仪器）
Microsoft Excel（微软公司）
SoftMax Pro 6（Molecular Devices，LLC）
GraphPad Prism 7（GraphPad Software，Inc）

程序

样品制备
如果使用细胞，则使用至少3 x 10 6 细胞。从平板吸出培养基，用PBS洗涤，收集细胞用一次性细胞提升器刮擦平板，并通过离心沉淀（30秒，在2,000 x g ）。吸出上清液，然后进入步骤A1。如果从组织样品中测量NAD + ，则切下约20mg组织并将该片放入2ml管中。然后进入步骤A1。对于以下所有步骤，样品应保存在冰上。
考虑NAD + 或NADH量化，区分这两者的唯一步骤是提取部分。从步骤A2开始，NAD + 和NADH的过程相同。
1. 萃取：
  1. 对于NAD + ：通过添加 10％TCA （在水中稀释）开始提取NAD + 。
  2. 对于NADH：用500mM NaOH和5mM EDTA提取NADH。
  注意：如果使用细胞，加入250μlTCA;如果使用组织，加入300μlTCA。
2. 用剪刀和机械均化器将组织样品均化，直到没有可见的块状物。在此过程中始终将样品保存在冰上。
  注意：如果使用单元格，请跳过此步骤。
3. 超声处理样品3次，每次5秒。配置中等功率的设备。
  注意：对于NADH：此时，在60°C加热30分钟。
4. 通过在11,500 x g离心2分钟，4℃下离心沉淀蛋白质。将上清液转移到新的1.5 ml管中，并将其用于步骤A6。
5. 保存颗粒以便以后测定蛋白质。将沉淀重悬于NaOH中：
  1. 细胞：0.2M NaOH，基于颗粒大小的体积;大约100μl（总是更好地使用较低的体积并稀释蛋白质样品后，而不是使用更大的体积并稀释太多）。样品应保存在冰或摇动平台上，温度为4°C，直至完全溶解。
  2. 组织：1M NaOH，至少300μl。将样品放在摇床上4°C过夜，然后测量蛋白质浓度。
  3. 我们通过Bradford蛋白质测定法测量蛋白质浓度。
6. 使用有机溶剂去除TCA
  1. 有机溶剂：制备新鲜的TCTFE溶液：三辛胺（3：1比例）。仅使用塑料吸头和管（TCTFE = 1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷）。
  2. 加入有机溶剂以2：1的比例除去TCA（步骤A4的上清液）。
  3. 剧烈涡旋15秒，使混合物在室温下分离3-5分钟。
  4. 用塑料移液管小心地取出含有NAD + （100μl）的顶层水层（图1），将其放入新的1.5 ml管中，加入10μl1M Tris进行调整pH值为8.0。
    注意：如果错误地将底部有机层扰动或吸出，请将其放回原处，并重复步骤A6c和A6d。
  5. 将样品置于冰上并进行酶制备步骤。此时，样品可以在-80°C冰箱中冷冻，并且可以在另一时间恢复操作，但建议在可能的情况下继续进行操作和读数，以最大限度地降低冻融循环中降解的风险。
    
    图1.去除顶层水层
7. 在该步骤中，考虑标准曲线的范围，在磷酸钠缓冲液中稀释NAD + 样品。对于所有样品，NAD + / NADH测量必须在曲线内。稀释度根据组织或细胞的类型和大小而变化。它基本上是经验性的。通常对于20mg组织，稀释度范围为1：500至1：1,000。对于细胞，稀释度通常为1:50至1：200。记住这不是僵硬的;有时需要更低或更高的稀释度。将NAD + 样品稀释至最终体积至少250μl。
准备NAD + 标准曲线
1. 为了获得最终的NAD + 1μM浓度，必须进行如下所示的连续稀释：
  1. 在1.5 ml微量离心管中，称取β-NAD钠盐（约1 mg）。
  2. 使用β-NAD钠盐分子量找到比容，得到10 mM的溶液。
  3. 为了获得10μM的中间浓度，在磷酸钠缓冲液中稀释10 mM 1：1,000。
  4. 最后，为了使溶液浓度为1μM，在磷酸钠缓冲液中稀释10μM1：100。
2. 为获得标准曲线，按照下表1稀释磷酸钠缓冲液中1μM的NAD + 原液。
  
  表1. NAD + 标准曲线
准备酶
1. 基于表2：
  ADH的库存必须为3400 U / ml。
  Diaphorase的库存必须为100 U / ml。
2. 称取1.5ml试管中的酶，制备1ml溶液。检查所用瓶子中的U / mg含量，因为它可能会根据批号而改变。
  注意：
  1. 通常，我们准备1毫升每种酶溶液，并分成足够大小的等分试样，以制备至少1个平板（96孔），以避免每次解冻整个量。
  2. 我们建议准备大约3-4％的体积（100个孔而不是整个板的96个孔），考虑到将溶液移动到另一个管（例如，连接到管壁，到移液器吸头）。
3. 通过将酶在30％（300μl）的磷酸钠缓冲液和70％（700μl）的4％活性炭悬浮液中稀释至总共1ml溶液，从心肌黄酶和ADH中除去结合的NAD + 。轻轻混合溶液，在37°C下孵育40分钟。每10分钟轻轻混合。
4. 通过离心5分钟，4℃和13,500 x g 除去木炭。将上清液转移到新管中，离心2分钟，4°C和13,500 x g 。
准备反应混合物
1. 在冰上解冻FMN，并将其置于室温。
2. 尽可能在水中制备20 mM的刃天青，并在同一天使用（保护它免受光照直至使用）。
  注意：根据制造商的说明，小剂量的刃天青原料可以在-20°C下储存长达1个月（应保护储备溶液避免暴露在光线下）。需要使用时，将其在冰上解冻。
3. 按照下表2制备反应混合物，考虑每种组分的添加量和顺序。
  
  表2.反应混合物制备
设置板
1. 将100μl样品/标准品加入96孔不透明板的孔中。
2. 用重复移液管向每个孔中加入100μl反应混合物。将96孔板放入荧光板读数器中。监测60分钟，激发波长为544nm，发射波长为590nm（视频1）。
  
  视频1
3. 在模板编辑器上，配置NAD + 标准品的稀释和单位，以及样品稀释（图2）。
  
  图2.板块布局

数据分析

所需数据：在荧光板读数器中获得的NAD + 值（图3A），蛋白质浓度，TCA的体积10％和使用的NaOH。
通过将获得的NAD + 值（以μM计）除以TCA的体积（以ml计），计算nmD中的NAD + 浓度。
通过将蛋白质浓度（mg / ml）除以其中重悬浮颗粒的NaOH（ml）的体积来计算样品中存在的蛋白质（mg）的质量。
将步骤2中获得的NAD + 浓度除以步骤3中获得的蛋白质质量。这是最终结果（图3B）。
将结果（nM / mg蛋白质）绘制在图表中。
根据需要进行统计分析。

图3.数据分析。 A.来自读板器的原始数据;环绕的细节显示基于稀释的调整结果。 B.最终图表的例子。

食谱

有机溶剂
准备新鲜的TCTFE溶液：三辛胺（3：1比例）
仅使用塑料尖端和管（TCTFE = 1,1,2-三氯-1,2,2-三氟乙烷）
100 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）
在1升容量瓶中：
加入93.2ml 1M Na 2 HPO 4 ，然后加入6.6ml 1M NaH 2 PO 4 < br /> 使音量达到1 L
缓冲液可在4°C下储存长达1个月
20 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）
使用100 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）进行1：5稀释最终体积为500 ml时，向烧杯中加入100 ml 100 mM磷酸钠缓冲液（pH 8.0）
使用1N HCl溶液调节至pH7.0 使用量筒将体积调至500毫升
在室温下储存
4％木炭悬浮液（20mM磷酸钠，pH7）
称重4克木炭
将其转移至量筒并加入100ml 20mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）
在室温下储存
布拉德福德染料
稀释Bio-Rad蛋白质分析染料试剂浓缩液1：5在水中
当保持在室温下时，稀释的试剂可以使用约2周
Tris缓冲液（1M，pH 8.0）
将8毫升蒸馏水放入合适的容器中向溶液中加入1.21克Tris碱用HCl调节溶液的pH值至8.0 加入蒸馏水直至体积为10毫升

第二部分：超高效液相色谱（UPLC） - 质谱法

材料和试剂

Agilent Poroshell 120 EC-C18预柱（Agilent Technologies，目录号：693775-902）
Agilent Poroshell 120 EC-C18分析柱（Agilent Technologies，目录号：697975-902T）
甲酸（Fisher Scientific，目录号：A117-50）
乙腈（Sigma-Aldrich，目录号：271004）
NAD（Sigma-Aldrich，目录号：N3014）
NADH（Sigma-Aldrich，目录号：N6005）
正环己基苯甲酰胺（内标 - IS）（西格玛奥德里奇，目录号：R531332）
自动进样器样品瓶（Chrom Tech，目录号：CTI-9405）
光滑微量离心管（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：02-681-320）
主要原料解决方案（见食谱）

设备

LC-MS / MS系统
注意：LC-MS系统由Waters ACQUITY H级超高效液相色谱（UPLC）系统组成，包含四元溶剂管理器和样品管理器-FTN，与Xevo TQ-S质谱仪（Waters，Milford）相连，MA）配备电喷雾电离（ESI）源。

软件

Waters MassLynx v4.1软件

程序

NADH和NAD + 的液相色谱分离使用Agilent Poroshell 120 EC-C18预柱（2.1 x 5 mm，2.7μm，Chrom Tech，Apple Valley，MN）连接到Agilent Poroshell 120 EC-C18分析柱（2.1 x 100 mm，2.7μm，Chrom Tech，Apple Valley，MN），温度为40°C。
用含有0.1％甲酸（A）的水和含有0.1％甲酸（B）的乙腈（ACN）组成的梯度流动相洗脱色谱柱，流速恒定为0.5 ml / min，总运行时间为10 min 。洗脱在100％A下开始并保持2分钟，然后B从0％线性增加至60％B 4分钟，60％B保持1分钟，并在2分钟内恢复到初始条件，最后完成2.8分钟，100％A。
自动进样器温度为4°C，进样体积为10μl。 NAD + 和NADH应分别洗脱1.6和3.5分钟。其他NAD + 相关代谢物（包括NADP，NADPH，ATP，NAADP，NAAD，ADP，cADPR，ADPR，烟酰胺和烟酸）均未与NAD + <共洗脱。 / sup>或NADH。
以与用于循环测定的“样品制备”中所述相同的方式制备组织样品。样品应在冰上解冻，并在含有500 ng / ml内标的水中稀释。
用于NAD + 测量的样品以1：1,000和1：10,000稀释，而用于NADH样品的样品在光滑的微量离心管中以1：1,000稀释。稀释后，应将样品涡旋并转移至2 ml自动进样器样品瓶中进行立即分析。

数据分析

通过Waters MassLynx v4.1软件获取和分析数据。 NAD + 和NADH的检测使用质谱仪在正ESI模式下使用毛细管电压3.5 kV，源温度150°C，去溶剂化温度500°C，锥形气体流量150 L / h，去溶剂化来完成气体流量500 L / h，采用多反应监测（MRM）扫描模式，停留时间为0.075秒（图4）。锥电压和碰撞能量由MassLynx-Intellistart，v4.1，软件确定。价值观如下：
NAD + -m / z 664.27＆gt; 136.09-锥形电压54 V-Collision 42 eV
NADH-m / z 666.28＆gt; 514.17 - 锥形电压56 V-Collision 26 eV
n-环己基苯甲酰胺-m / z 204.1> 122.00-锥形电压80 V-Collision 20 eV

图4. LC-MS追踪分析

食谱

主要库存解决方案
将初级储备溶液储存在-80℃下，并如下制备在硅烷化玻璃小瓶中：
NAD + （10 mg / ml水溶液）
NADH（在0.01N NaOH中1mg / ml，pH 11.9）
n-环己基苯甲酰胺（IS）（在EtOH中100μg/ ml）
对于工作标准：
通过将储备溶液稀释到上述相同的溶液中来制备工作标准。通过在含有500ng / ml内标的水中1:20稀释上述储备液来制备每日标准样品

致谢

这项工作部分得到了泰德纳什长寿基金会，格伦医学研究基金会通过梅奥诊所老年生物学保罗F.格伦实验室的资助，国家梅奥基金会卡利科实验室的资助。健康研究所（NIH）从国家老龄化研究所（NIA，批准号AG-26094），NIH / NCI到ENC的胰腺癌SPORE项目（授权号CA102701-08），Mayo细胞诊所中心获得资助胃肠病学信号（NIDDK P30DK084567）。
利益声明：Chini博士拥有CD38抑制剂用于代谢疾病的专利。

参考

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