材料和试剂

组织破坏
1. 2毫升微量离心管
2. 玻璃珠，直径4毫米（Walter Stern，目录号：100E）
3. 拟南芥
4. 液氮
DNA分离
1. 1.5毫升微量离心管
2. 氯仿/ IAA混合物（24：1）
3. 异丙醇（CAS号67-63-0）
4. 乙醇（200标准）（CAS号64-17-5）
5. 70％乙醇
6. Tris-HCl（pH 7.5）
7. Tris碱（CAS号77-86-1）
8. EDTA游离酸（CAS号60-00-4）
9. NaCl（CAS号7647-14-5）
10. CTAB（CAS号57-09-0）
11. RNase A（Sigma-Aldrich，目录号：R6513）
12. 氯化铯（CsCl）（CAS号7647-17-8）
13. 2％CTAB解决方案（见食谱）
14. TE缓冲区（见食谱）
15. RNase A储备液（见食谱）
16. 1 M CsCl溶液（见食谱）
PCR

光学薄膜（Bio-Rad Laboratories，目录号：2239444）
96孔硬壳黑白板（Bio-Rad Laboratories，目录号：hsp9665）
LC Green Plus（BioFire Defense，目录号：BCHM-ASY-0006）
Phire Hot Start II DNA聚合酶和缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号：F122）
dNTP，各100mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：10297018）
矿物油（Fisher Scientific，目录号：O121-1）
琼脂糖（CAS号9012-36-6）
PCR引物
冰醋酸（CAS号64-19-7）
TAE缓冲区（见食谱）

设备

LightScanner系统（BioFire Defense，USA）
PCR仪（Bio-Rad C1000）（Bio-Rad Laboratories，型号：C1000）
Tissue研磨机（Mini-Beadbeater-96，Biospec，OK，USA）（Bio Spec Products，型号：Mini-Beadbeater-96）
台式离心机（Eppendorf，型号：5427 R）
涡旋混合器（Fisher Scientific，目录号：02-215-365）

软件

LightScanner软件

程序

基因组DNA分离
1. 将新鲜组织的0.1-0.2g（来自拟南芥的一个成熟叶，长度约20mm，不包括叶柄）收获到含有4mm玻璃珠的2ml微量离心管中并立即在液氮中冷冻。在液氮中研磨组织。包括至少两种野生型（或突变体的同基因背景）样品。我们使用迷你珠打浆机来磨削组织。＆nbsp;
2. 加入300μlChl/ IAA和300μl2％CTAB溶液，涡旋10秒。
3. 在65°C孵育30分钟。
4. 以最高速度，4°C，10分钟离心。
5. 将水相转移至新鲜的1.5ml管中并加入300μlChl/ IAA。涡旋10秒，并以最大速度（18,210 x g ），4℃，10分钟离心。
6. 将水相转移至新鲜的1.5ml管中并加入等体积的异丙醇。涡旋10秒。
7. 通过在-20℃下孵育管10分钟来沉淀基因组DNA。
8. 以最大速度（18,210 x g ）离心，4°C，10分钟。
9. 弃上清，用70％乙醇洗涤一次，干燥沉淀。加入50μlTE缓冲液+0.5μlRNase原液。轻轻混合内容物以溶解颗粒。如果它不易溶解，请在65°C下加热管。在37°C孵育30分钟。
10. 加入400μl1M CsCl溶液并充分混合。
11. 加入800μl乙醇，混合，让基因组DNA在-20°C下沉淀20分钟。
12. 以最大速度（18,210 x g ）离心，4°C，10分钟。
13. 弃去上清液，用700μl70％乙醇洗涤沉淀。再次离心管并丢弃剩余的乙醇。
14. 将干燥的沉淀溶解在50μlTE缓冲液中。 DNA可以在-20°C下储存。
  注意：上述方法可生成高质量的DNA样本，这对下游分析的重现性非常重要。只要DNA质量可比，其他基因组提取程序可用于代替上述方法。＆nbsp;
入门设计
应设计位于预测编辑站点侧翼的引物。我们通常设计产生80-120bp片段的引物组。 <扩增子尺寸> 150 bp可能会降低HRM分析的敏感性（Gundry et al。，2013）。 T m 应为58±2°C，GC含量不应超过65％（Laurie和George，2009）。
优化PCR协议
1. 将PCR混合物吸移到1.5ml管中，每次反应含有下列组分。我们建议在T m 周围测试温度±3°C，并进行两次技术重复。
  4μl5xPhire反应缓冲液
  2μldNTP，每种2.5 mM
  2μl正向引物，5μM
  2μl反向引物，5μM
  步骤A14的2μl基因组DNA，在水中1/10稀释 0.4μlPhireHot Start II DNA聚合酶
  5.6μl水
2. 运行梯度PCR方案如下：
3. 在TAE缓冲液中的4％琼脂糖凝胶上运行PCR产物。选择不产生非特定辅助波段的条件。
  注意：通过在衰减曲线中产生多个峰值，其他非特异性条带将使HRM分析复杂化（参见图1中的示例）。
  注意：
  1. 为了制备4％凝胶，建议将琼脂糖和TAE混合，并在微波处理前保持水合30分钟。这一步促进了均匀融化。
  2. 理论上，任何PCR酶都可以与LC green结合使用。在我们的手中，Phire Hot Start II聚合酶产生了最强大的结果。
  图1.受非特异性条带影响的熔解曲线。 A.产生非特异性条带的引物组合。插图显示了使用相同的组合引物产生的代表性PCR产物，在4％琼脂糖凝胶上可视化。 B.来自引物组合的熔解曲线，其不产生非特异性条带。
HRM分析
1. 将PCR预混合物制成1.5ml管，每次反应含有下列组分。我们强烈建议每个样本至少进行两次技术重复。
  4μl5xPhire反应缓冲液
  2μldNTP，每种2.5 mM
  2μl正向引物，5μM
  2μl反向引物，5μM
  2μlLC绿色染料
  0.4μlPhireHot Start II DNA聚合酶
  5.6μl水
2. 将18μl每种主混合物吸移到96孔黑白PCR板中。从未知样品中加入2μl1/ 10稀释的基因组DNA。每孔加20μl矿物油，用光学薄膜密封。
  注意：如果用于生产HRM的仪器是顶部加热的，则不需要矿物油。
3. 进行PCR反应。
  
  注意：*上述两个步骤对于在WT和突变DNA之间形成PCR产物之间的异源双链是至关重要的。
4. 短暂离心板以除去任何冷凝或气泡。
5. 使用LightScanner或能够执行HRM分析的等效机器获得熔化曲线。在作者的实验室中，使用的温度范围为75°C至100°C。 LightScaner以约0.1°C的间隔记录每个孔的荧光强度。一旦熔化完成后，结果将自动保存为.mat文件。

数据分析

此步骤取决于可用于数据分析的软件，通常由配备HRM分析功能的机器制造商提供。在此示例中，我们将展示如何分析使用LightScanner获取的数据集。以下部分中描述的步骤也可以在视频1中进行。

视频1
概述：分析基本上包括四个步骤：1）指定实验组; 2）确定待分析的熔解曲线的范围; 3）选择参考曲线（通常是从WT生成的曲线;和4）基于与参考曲线的差异调用突变。

打开LightScanner软件，然后单击小扩增器。在弹出窗口中，选择要分析的已保存实验文件（.mat文件）。
定义子集
1. 点击顶部的子集标签，然后点击新子集按钮。在顶部的96孔格式网格中，单击包含样品的孔。每个引物组合应该是一个子集。完成后，单击添加标记到子集。定义所有子集（图2）。
  
  图2.子集选择屏幕。通常，所有与一种引物组合的反应都被指定为一个子集。
2. 定义子集后，您可以通过单击选择要编辑的子集按钮来查看特定子集。
添加样品名称
打开顶部的样本标签，然后输入所有样本名称（图3）。

图3.可以在Samples选项卡
下指定样品名称
调用样本之间的差异
1. 点击顶部的基因分型标签，然后点击标准化标签，选择包含待分析范围的范围。包括熔化前后的平台（图4）。
  
  图4.选择要分析的熔解曲线窗口。两条垂直线代表用于标准化的区域的开始和结束。
2. 如果您试图调用突变体和WT之间的差异，应将WT的解链曲线设置为基线。为此，请单击选择基线，单击包含要用作基线的样品的孔，然后单击完成选择。在此之后，重新计算归一化的熔解曲线（下图）以将WT曲线设置为基线（图5）。
  
  图5.选择基线曲线注意与图3的不同之处，其中未指定基线。其他曲线根据基线曲线重新计算。
3. 现在，可以自动或手动调用组。要自动呼叫不同的组，请选择自动组选项，然后更改灵敏度级别（图6）。
  
  图6.自动群组调用。在这种情况下，以红色和蓝色显示的样本将被称为与有基线的小组。
4. 或者，可以手动设置组。要执行此操作，请在“编辑组”下，按添加组 p 。然后单击包含属于同一组的样品的孔（例如，从一个基因型复制），然后在编辑调用下，按应用更改。现在该组以不同的颜色显示。可以重复该过程以添加其他组（图7）。＆nbsp;
  
  图7.手动选择组。已使用协议中详述的步骤手动指定组。
  N ote：为了准确预测，WT样本中 Δ F luorescence的变化应该是＆lt; 0.05。手动模式有助于识别不同的样品并检查它们之间是否存在明显差异。作者使用 Δ 荧光＆gt; 0.1与WT相比，作为潜在突变体的经验法则，并在稍后通过Sanger测序分析PCR片段。

食谱

2％CTAB解决方案
100mM Tris-HCl（pH 8.0）
20 mM EDTA（pH 8.0）
1.4 M NaCl
2％CTAB
高压灭菌器
TE缓冲区
10mM Tris-HCl（pH 8.0）
1 mM EDTA（pH 8.0）
高压灭菌器
100x RNase A库存解决方案
10 mM Tris-HCl（pH 7.5）
15 mM NaCl
10 mg / ml RNase A
在100°C下煮沸5分钟，冷却并储存在-20°C
1 M CsCl
溶于蒸馏水，高压灭菌
50x TAE缓冲区
2 M Tris base
50 mM EDTA（pH 8.0）
5.71％（v / v）冰醋酸

致谢

这项工作得到了美国国家科学基金会MCB 1052048（S.O.），IOS 1403593和德克萨斯A＆amp; M大学AgriLife研究的支持。该协议已经部分改编自我们之前的出版物（Denbow et al。，2017）。作者声明没有利益冲突。

参考

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