材料和试剂

BrandTech TM BRAND TM 试剂库（BrandTech Scientific，目录号：703459）
铝箔18英寸x 500英尺（Sigma-Aldrich，目录号：Z185159-1EA）
BD注射器带各种吸头，60 ml（BD，目录号：309653）
BD诊断系统SYR仅Luer-Lok TM 10 ml 200PK RX（赛默飞世尔科技，目录号：B302995）
制造商：BD，目录号：302995。
BD一次性注射器，带Luer-Lok TM 吸头，3 ml（BD，目录号：309657）
Fisherbrand TM 无菌酒精预备垫（Fisher Scientific，目录号：22-363-750）
BD Vacutainer TM 一般使用注射器针头（BD，目录号：305180）
Fisherbrand TM 硼硅酸盐玻璃一次性血清移液管，标准长度，标准长度，5 ml（Fisher Scientific，目录号：13-678-27E）
Fisherbrand TM 硼硅酸盐玻璃一次性血清移液管，标准长度，标准长度，10 ml（Fisher Scientific，目录号：13-678-27F）
Fisherbrand TM 硼硅酸盐玻璃一次性血清移液管，常规尖端，短长度，25 ml（Fisher Scientific，目录号：13-678-36D）
EMD Millipore TM Millex TM -GP PES膜无菌注射器过滤器（Fisher Scientific，目录号：SLGP033RS）
制造商：Merck，目录号：SLGP033RS。
康宁 TM 聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）离心管，15 ml（Corning，目录号：430055）
CELLSTAR TM Greiner Bio-One TM TC处理细胞培养瓶，250 ml（Greiner Bio One International，目录号：658175）
Fisherbrand TM 优质微量离心管，1.5 ml（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
Fisherbrand TM 低保留移液管吸头 - 过滤，10μl（Fisher Scientific，目录号：02-717-158）
Fisherbrand TM 低保留移液器吸头 - 过滤，20μl（Fisher Scientific，目录号：02-717-161）
Fisherbrand TM 低保留移液管吸头 - 过滤，200μl（Fisher Scientific，目录号：02-717-165）
Quibit TM 测定管（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：Q32856）
具有条形码的MicroAmp TM 光学96孔反应板（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4306737）
MicroAmp TM 光学胶膜（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4311971）
过滤器，瓶顶1升（Thermo Fisher Scientific，目录号：597-4520）
Dynabeads TM MPC TM -S磁粉颗粒浓缩器（赛默飞世尔科技，目录号：A13346）
Dynabeads TM MPC TM -6磁粉颗粒浓缩器（赛默飞世尔科技，目录号：12002D）
Dynabeads TM L10管（赛默飞世尔科技，目录号：74003）
VWR ® 8-425螺纹样品瓶（VWR，Avantor，目录号：66020-950）
顶盖黑色，带PTFE /硅胶预切口隔垫，10 mm，在干净的环境中包装（PerkinElmer，目录号：N9306052）
℃。 parvum 18S-rRNA引物：Cp18S-995F：5'-TAGAGATTGGAGGTTCCT-3'和Cp18S-1206R：5'-CTCCACCAACTAAGAACGCC-3'（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）
人18S-rRNA引物：Hs18S-F1373：5'-CCGATAACGAACGAGACACTCTGG-3'和Hs18S-R1561：5'-TAGGGTAGGCACACGCTGAGCC-3'（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）
Quant-iT TM Qubit RNA BR检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：Q10211）
RNeasy迷你套件，250（QIAGEN，目录号：74106）
RNase-free DNase set，50（QIAGEN，目录号：79254）
iScript TM RT-qPCR样品制备试剂（Bio-Rad Laboratories，目录号：1708898）
Luna ®通用一步法RT-qPCR试剂盒方案（New England BioLabs，目录号：E3005）
无菌磷酸盐缓冲盐水（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10010049）
含有L-谷氨酰胺和酚红的最低必需培养基（MEM），不含HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11095-114）
马血清，新西兰血清（赛默飞世尔科技，Gibco TM ，目录号：16050122）
UltraPure TM DNase / RNase-free蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：10977015）
乙醇，70％（Sigma-Aldrich，目录号：1009744000）
制造商：Merck，产品目录号：100974。
用于Accutrend ® Plus仪表的罗氏诊断 TM 葡萄糖试纸（Fisher Scientific，目录号：22-045-871）
制造商：Roche Diagnostics，目录号：11447475160
Crypt-a-Glo TM 试剂盒（水性，目录号：A400FLR-20）
Sporo-Glo TM （水性，目录号：A600FLR-20X）＆nbsp;
L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G3126）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270）
抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A0278）
对氨基苯甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：A9878）
泛酸钙（Sigma-Aldrich，目录号：C8731）
叶酸（Sigma-Aldrich，目录号：F7876）
肝素（Sigma-Aldrich，目录号：H3393）
抗生素/抗真菌药100x（赛默飞世尔科技，目录号：15240062）
牛磺酸脱氧胆酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：T0557）
巯基乙酸（MP Biomedicals，目录号：102933）
甘露醇（Sigma-Aldrich，目录号：M4125）
谷胱甘肽（Sigma-Aldrich，目录号：G6013）
牛磺酸（Sigma-Aldrich，目录号：T8691）
甜菜碱盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：B3501）
半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C7352）
油酸（Sigma-Aldrich，目录号：O1257-10MG）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录号：C4951-30MG）
Dynabeads TM anti- Cryptosporidium （赛默飞世尔科技，目录号：73011）
氮医用级99.998％纯度（TW Smith，Brooklyn，NY）
二氧化碳，骨干，99.998％（TW Smith，Brooklyn，NY）
ECS中等混合（见食谱）
ICS中等混合（见食谱）
胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红（Thermo Fisher-Scientific，Gibco TM ，目录号：25200056）＆nbsp;

设备

1 L瓶，33 mm盖（Fisher Scientific，目录号：0642114）
制造商：DWK Life Sciences，目录号：61111T1000。
125毫升瓶，33毫米盖（DWK生命科学，目录号：219755）
罗氏诊断 TM 葡萄糖控制用于Accutrend ® Plus仪表（Fisher Scientific，目录号：22-045-733）
制造商：Roche Diagnostics，目录号：05213231160。
Hausser TM Levy TM 血细胞计数器室组（Hausser Scientific，目录号：3520）
FiberCell TM Systems Duet Pump（FiberCell Systems，目录号：P3202）
中空纤维介质盒（FiberCell Systems，目录号：C2011）
UVP UV2灭菌PCR工作站（VWR，Avantor，Bridgeport，NJ 08014，USA）
II级，A型，生物危害柜，型号10276（Envirco Cedar Grove，NJ 07009，USA）
Beckman Coulter Microfuge ® 16离心机（Beckman Coulter，型号：Microfuge ® 16）
Eppendorf TM 离心机5810R（Eppendorf，型号：5810 R）
Quant Studio 6 Flex 44（Applied Biosystems，Life Technology，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）
Thermo Scientific Revco Ultima CO 2 培养箱（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）
Dynabeads TM MX混合器基础（赛默飞世尔科技，目录号：15902）
Qubit TM 3.0荧光计（赛默飞世尔科技，目录号：Q33216）
Nikon TM Optiphot荧光显微镜（Nikon，Westbury，NY）
Fisher Scientific Accumet ® AR10 pH台式仪表（Fisher Scientific，目录号：13-636-AB150）
Fisher Scientific干浴培养箱（Fisher Scientific，目录号：11-718-2）
高压灭菌器（LBR Scientific，Rutherford，NJ）＆nbsp;

软件

Quant Studio RT-PCR软件v1.0（Applied Biosystems，Life Technology，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）
Sigma Plot v2001（Systat Software，Inc，San Jose，CA，USA）

程序

墨盒准备
1. 储罐盖/瓶组件的灭菌
  1. 将33毫升储液罐盖插入125毫升瓶中。松散地安装螺帽。
  2. 将墨盒附带的新储液器盖管（非无菌）连接到盖子上。
  3. 用箔片将Luer接头松散地包裹在储液器盖管的末端。
  4. 将整个组件放入高压灭菌袋中并密封。
  5. 在121℃，15磅/英寸 2 高压灭菌20分钟（高真空）。
2. 将储液罐盖连接到流路
  1. 从包装中取出Fibercell模块。检查中空纤维模块和流路之间的鲁尔接头，确保它们用手指拧紧。
  2. 从储液器盖上的一个鲁尔接头上取下箔片。
  3. 选择流路上的其中一个鲁尔接头。用70％乙醇喷洒并用酒精垫擦拭。
  4. 从Luer接头上取下Luer盖子，将Luer接头连接到33 ml储液器盖上。在连接之前，将½转反向旋转到管道上，以防止管道扭结。
  5. 重复步骤以连接其他Luer配件。
  6. 检查配件并确保它们紧密连接。
预培养
当使用粘附细胞时，应在用125ml细胞培养基填充盒之前，用2体积的125ml无菌PBS洗涤盒24小时。
1. 确保左右端口侧夹具打开。无菌地将100毫升无菌PBS装入125毫升瓶中，使用33毫米盖子将其连接到药筒上（流动路径和用于中型药筒的药筒容纳约30毫升培养基）。
2. 使用拇指和食指手动灌注泵，直到空气被推出管道然后关闭左右端口侧夹。＆nbsp;
3. 用无菌PBS填充无菌60 ml注射器并连接到左侧毛细管外空间（ECS）端口，并将空的60 ml注射器连接到正确的ECS端口。
4. 打开左侧和右侧ECS侧端口上的夹子，将无菌PBS推入ECS。向上倾斜墨盒并填充介质，注意去除ECS中存在的所有空气。如果音量不够，请重复。
5. 关闭左侧和右侧ECS侧端口，喷洒70％酒精并取出注射器，喷洒70％酒精并用酒精垫擦拭，然后将干净的无菌3 ml注射器连接到端口。打开左侧和右侧端口夹。
6. 将Fibercell中空纤维模块连接到37°C 5％CO 2 培养箱中的Fibercell泵装置。设定中等流速为5，离开24小时。
7. 24小时后，关闭左右端口夹具，无菌地更换PBS储液瓶，用于装有100ml无菌PBS的新鲜125ml瓶子，并返回培养箱24小时。
8. 用100ml MEM培养基无菌填充无菌125ml储液瓶。将储液罐盖松开½圈。
9. 用无菌MEM填充无菌60 ml注射器并连接到左侧ECS端口，并将空的60 ml注射器连接到正确的ECS端口。＆nbsp;
10. 打开左侧和右侧ECS侧端口上的夹子，将无菌MEM推入ECS。向上倾斜墨盒并填充介质，注意去除ECS中存在的所有空气。如果音量不足，请重复
11. 关闭左侧和右侧ECS侧端口，喷洒70％酒精并取出注射器，喷洒70％酒精并用酒精垫擦拭，然后将干净的无菌3 ml注射器连接到端口。打开左侧和右侧端口夹。
12. 将Fibercell中空纤维模块连接到37°C，5％CO 2 培养箱中的Fibercell泵装置。设定中等流速为5并过夜。
13. 使用MEM加10％马血清重复步骤B8-B12。
将细胞接种到ECS中（参见视频1）

视频
1. 关闭左右端口滑动夹。
2. 使用胰蛋白酶-EDTA（0.25％），酚红，用MEM洗涤HCT-8单层胰蛋白酶，并在总体积为5ml的ICS混合物中重悬浮1×10 6 （参见方法2），并放入槽中。
3. 用70％乙醇喷涂左侧端口Luer连接，并用酒精垫擦拭。用酒精垫取下注射器。
4. 使用带有钝端针的10 ml注射器吸取细胞。
5. 按照相同的无菌程序，将空注射器连接到右侧端口Luer配件上。
6. 如果关闭，请打开侧面端口夹。
7. 通过ECS在2个注射器之间来回轻轻冲洗细胞悬液3-5次。这确保了细胞的分布。
8. 松开储液罐盖½转。
9. 让左端口滑动夹关闭。打开右端口滑动夹。这将允许过量的介质流入储液瓶。
10. 关闭右侧端口滑动夹。
11. 轻轻按下连接在左侧端口的注射器柱塞，直到所有介质和细胞都被压入ECS。
12. 关闭左侧端口滑动夹并打开右侧端口滑动夹。
13. 轻轻按下连接在右侧端口的注射器柱塞，直到所有介质和细胞都被压入ECS。
14. 关闭侧面滑动夹。用新的无菌注射器更换注射器。
15. 拧紧油箱盖。
16. 打开左端口滑动夹。
17. 将药筒放入37°C，5％CO 2 培养箱内的Fibercell泵中，并将流速设置为5. 3天后，将流速增加到10。
添加 C. parvum 卵囊
每天更换新鲜MEM和10％HS。使用Accumet ® pH计和Accutrend Plus ®血糖仪在ECS中监测48小时和新鲜培养基的pH和葡萄糖浓度。当葡萄糖在24小时内下降50％时，ECS接种1×10 5 C.用10％Chlorox ®处理过的卵囊卵囊，每次用30ml无菌蒸馏水洗涤7次，并悬浮于含有配方1（ECS混合物）中所示补充剂的10ml MEM中。毛细血管内空间（ICS）培养基被替换为配方2（ICS混合物）中所示的培养基。
1. 将设备拆至无菌罩并将L和R端口夹滑动至关闭状态。
2. 使用酒精垫用70％酒精喷洒左右ECS端口，然后从左侧ECS端口取下注射器。
3. 连接含有10 ml C的注射器。 parvum 卵囊悬浮在ECS混合物中的左侧ECS端口。
4. 将干净的无菌10 ml注射器连接到正确的ECS端口。
5. 打开左侧和右侧ECS端口的滑动夹。向下推动连接到左侧端口的注射器（包含 C。parvum 卵囊），轻轻向上拉右侧注射器。
6. 当左注射器完全按下时，向下按右注射器以混合ECS的内容物。
7. 重复该过程（步骤5和6）3-4次，最后左右注射器大约50％满（每个5毫升）。
8. 关闭右侧ECS端口夹，打开右端口滑动夹。向下推动连接到左ECS端口的注射器，直到内容物已添加到ECS中（注意不要向盒中添加空气）。将左ECS端口夹滑动关闭。打开右侧ECS滑动夹并向下按压注射器，直至添加到此端口的注射器内容物（注意不要向墨盒中添加空气）。滑动右侧ECS端口夹闭合。当最初接种药筒时，使用者应经历最小的背压，在连续培养几个月（> 6个月）之后，可能经历由于宿主细胞层的积聚和来自脱落细胞的碎片而经历的背压增加。在连续培养一年后使用3 ml ECS滤芯时，背压很明显，不建议用于超出此点的研究。 20毫升ECS滤芯保持2年以上没有遇到这个问题，是长期研究的首选滤芯。
9. 滑动左端口夹以打开。用70％酒精喷洒左右ECS端口，并使用酒精垫取下注射器，并用干净无菌的10 ml注射器更换。
10. 确保关闭左右端口夹具，并用125 ml完整的ICS培养基混合物替换储液瓶（配方2）。打开左右端口并将墨盒返回泵。将流速设为10.
11. 通过直接从储液瓶中取出5ml，每天监测ICS培养基中的pH和葡萄糖。当葡萄糖浓度从360mg / dl下降到约。在24小时内200mg / dl，更换储液器以获得500ml瓶子的完整ICS培养基混合物，其含有460mg / dl葡萄糖。
12. 继续监测pH和葡萄糖，当葡萄糖浓度在24小时内降至50％（200-230 mg / dl）时，更换储液罐以获得1 L瓶含有500 mg / dl葡萄糖的完整ICS培养基混合液。
13. 在培养期间每48小时监测pH和葡萄糖，作为宿主细胞层完整性的指示。
分析 C。通过 Cp 18S-rRNA的变化实现细胞生长 RNA准备：
1. 离心50μl样品，弃去上清液，加入100μliScriptBuffer（裂解缓冲液）。
2. 通过在液氮中浸泡1分钟冻结/解冻6x，然后在70℃下快速解冻1.5分钟。
3. 将裂解物在16,162 x g （14,800rpm）下离心5分钟。
4. 小心地将上清液用200μl移液管（请勿触摸PELLET）转移到干净的试管中。
5. 向裂解物中加入1体积的70％乙醇，并通过移液充分混合。不要离心。
6. 将最多700μl的样品（包括任何沉淀物）转移到置于2 ml收集管中的RNeasy Mini离心柱中。
7. 在8,000 x g （10,412rpm）下离心15秒。丢弃流量。
8. 向色谱柱中添加350μlBufferRW1。在8,000 x g （10,412 rpm）下离心15秒。
9. 将10μlDNaseI储备溶液加入70μl缓冲液RDD中。通过倒置管轻轻混合。在8,000 x g （10,412 rpm）下离心15秒。
10. 将步骤E9中的DNase I孵育混合物（80μl）添加到柱膜中并放置在台面上15分钟
11. 将350μl缓冲液RW1添加到色谱柱中。在8,000 x g （10,412rpm）下离心15秒。丢弃流量。
12. 向色谱柱中加入500μl缓冲液RPE。在8,000 x g （10,412rpm）下离心15秒以洗涤膜。丢弃流量。
13. 向色谱柱中加入500μl缓冲液RPE。在8,000 x g （10,412rpm）下离心2分钟。通过
  放弃流程
14. 将色谱柱放入新的1.5 ml收集管中。将30-50μl不含RNase的水直接加入柱膜中。在8,000 x g （10,412 rpm）下离心1分钟以洗脱RNA。标记管，样品描述，日期和添加的水量。
15. 立即定量RNA或将样品保存在-80°C。
16. 根据制造商的说明，使用Qubit 3.0荧光计，使用广泛的Qubit RNA测定试剂盒对RNA进行定量。
17. 枚举 C.通过在HFB样品中定量 Cp 18S-rRNA并将其与使用10 6 ，10 7 和10制备的标准进行比较，得到parvum 8 C. parvum 卵囊。使用含有 C的Luna Universal One-Step ® RT-qPCR试剂盒（NEB E3005），使用5 ng RNA进行该程序。 parvum 18S-rRNA引物：（Cp18S-995F：5'-TAGAGATTGGAGGTTCCT-3'和Cp18S-1206R：5'-CTCCACCAACAGAGAACGCC-3'）并将其与人18S-rRNA引物进行比较：（Hs18S-F1373： 5'-CCGATAACGAACGAGACACTCTGG-3'和Hs18S-R1561：5'-TAGGGTAGGCACACGCTGAGCC-3'）。使用Quant Studio 6 Flex 44按照制造商的说明执行此过程。
18. 在培养2周后，HFB可重复地每毫升产生5×10 6个 7 至10 8 卵囊，如果不超过50％的ECS体积被采样，则保持这一点。每7-10天一次。一次取样90％的药筒体积导致4周的恢复时间，以获得每毫升10 8 卵囊。
19. 根据制造商的说明用Crypt-o-Glo ®染色卵囊，并使用Nikon TM Optiphot荧光显微镜进行评估。
20. 根据制造商的说明用Spor-a-Glo ®染色运动阶段，并使用Nikon TM Optiphot荧光显微镜进行评估。

有助于重现性的提示。

将入口和出口管线保持在用于灌注泵的管线后面的储液瓶，这可以防止管线扭结并减少处理滤芯时污染的可能性。
更换注射器时，请使用酒精垫缠绕配件，以防止污染。
如果48小时后储液瓶的葡萄糖浓度没有显着下降，则通过在毛细管外空间添加10个 6 HCT-8细胞来补充宿主细胞。
实现 C的持续增长。 parvum ，重要的是保持毛细管外培养基的低氧化还原平衡。
注意：为实现这一目的，我们使用无菌蒸馏水制备氧化还原混合物，煮沸并用0.4μm过滤的N 2 吹扫加油站。当冷却至环境温度时，硫醇在N 2 气氛下溶解。
通过用等体积的新鲜ECS培养基置换额外毛细管培养基，可以除去50％（10ml）培养物。当移位细胞时，轻轻地压下注射器（10ml注射器10秒），以免引起湍流。建议在采样后10-14天不要扰乱培养物以使培养物重新繁殖。

数据分析

来自HFB的总寄生虫阶段的生长曲线
1. 从HFB中取出样品（0.5ml）并分离RNA并使用针对 C的特异性引物通过qRT-PCR分析。 parvum 18S-rRNA（Cp18S-995F：5'-TAGAGATTGGAGGTTCCT-3'和Cp18S-1206R：5'-CTCCACCAACAGAGAACGCC-3'）并与HCT-8 18S-rRNA（Hs18S-F1373：5'-）进行比较如Zhang和Zhu（2015）所述，CCGATAACGAACGAGACACTCTGG-3'和Hs18S-R1561：5'-TAGGGTAGGCACACGCTGAGCC-3'）计数寄生虫数量。在第15天，寄生虫数量从第1天的5×10 3 / ml增加至5×10 5 /μl/ ml / ml（图2）。使用Dynabeads从HFB样品中纯化卵囊，我们从10 ml培养体积中获得了10个 9 卵囊。
  
  图2. C. HFB中的parvum 增长曲线
2. ℃。 parvum 数字显示为每毫升总寄生虫阶段的对数。寄生虫数量通过qRT-PCR测定，使用如程序中所述的Cp-18SrRNA引物和使用10 3 ，10 4 和10 5 卵囊（Zhang和Zhu，2015）。在第1天用5×10 3 卵囊/ ml（10 5 ）接种培养物。结果表示为一式三份计数±SEM。
3. 用缀合荧光探针（Crypt-a-Glo ®）的 Cryptosporidium 卵囊壁蛋白的单克隆抗体染色卵囊，并使用具有激发波长的荧光显微镜检查410-485nm，发射波长515nm（图3A）。使用与红色荧光探针（Sporo-Glo ）缀合的多克隆抗体对运动细胞外阶段进行染色，并使用激发波长为535-550nm且发射波长为580nm的荧光显微镜进行检查。（图3B）。
  
  图3.从HFB收集的寄生虫的显微镜检查。 A.使用Crypt-a-Glo ®染色的HFB中的卵囊; B和C.使用Sporo-Glo ®染色的HFB的运动阶段。比例尺=5μm。
体内 HFB产生的感染性 C. parvum
从HFB培养物收集的卵囊用于感染TCR-α缺陷型小鼠以证明毒力因子的维持。在2D培养瓶中培养48小时的寄生虫不能在免疫抑制或免疫缺陷小鼠模型中引起感染。从HFB收集卵囊并使用Dyna珠子根据制造商的说明纯化。在C57BL / 6背景（Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME，USA）上的三组TCR-缺陷小鼠口服给药10 6 C.来自HFB的parvum 卵囊（在PBS中0.1ml），并与亲本Iowa分离物（阳性对照）的10 6 卵囊和给予0.1ml PBS（阴性对照）的小鼠进行比较。 C的体重增加存在统计学差异。与给予PBS的阴性对照相比，从10天开始感染小鼠（图4A），表明活性 C. parvum 感染。收集粪便颗粒并在PBS中软化，然后涂抹在显微镜载玻片上并通过改良的冷Kinyoun酸快速技术染色，并使用共聚焦显微镜（Nikon，Westbury，NY，USA）在400x下显微镜头计数。 7-10天后检测到卵囊，每天脱落最多25天（图4B）。

图4. 体内 C的分析。来自HFB的parvum 卵囊。 A.小鼠模型 C. parvum 感染。通过含有10μl

C的口服管饲法将0.1ml小鼠一式三份感染。 parvum 悬浮在PBS中的卵囊从HFB收集，六周大的 C. parvum 爱荷华州孤立（与用于启动文化相同的来源），并与用0.1毫升PBS强化的对照进行比较。每天称重小鼠。 B.通过HFB培养的小鼠模型感染的卵囊脱落。用0.1ml蒸馏水软化小鼠粪便并涂抹在载玻片上，用改良的冷Kinyoun酸快速技术染色，并用放大400倍的显微镜计数卵囊。
从HFB收集的卵囊的excystation
C的exorpstation率。将来自HFB的parvum 卵囊与对照爱荷华分离物卵囊进行比较，作为卵囊活力的指标。 ℃。将parvum 卵囊在含有150毫克牛磺胆酸钠和50毫克胰蛋白酶的PBS（pH 7.4）中于37℃温育30分钟，并使用Crypt-a-Glo ®和Sporo进行双重染色-Glo ®。通过使用荧光显微镜（Nikon Optiphot）以400x放大率使用血细胞计数器计数卵囊和子孢子来确定切除的卵囊的百分比。使用410-485nm的激发波长和515nm的发射波长显现Crypt-a-Glo ®染色的卵囊;使用535-550nm的激发波长和580nm的发射波长显现Sporo-Glo ®染色的子孢子（spz）。结果显示约。从HFB培养系统收集的80％的卵囊在30分钟内完成，这与用 C获得的数据相似。 parvum 父母爱荷华州孤立。来自HFB培养物和爱荷华州分离物的卵囊在4℃下储存，表明随着储存时间的延长百分比逐渐降低，降至约。 6个月后40％（图5）。

图5. C的Excystation。 parvum 卵囊卵囊在含有150毫克牛磺胆酸钠和50毫克胰蛋白酶的PBS（pH 7.4）中于37℃下切除30分钟。通过Crypt-a-Glo ®和Sporo-Glo ®双重染色并使用改进的Neubauer血细胞计数器计数来确定切除的卵囊的百分比。 excystation百分比由以下公式计算：spz count / 4 x oocyst count x 100％。
HFB葡萄糖浓度的变化
测量毛细血管内和毛细血管外空间的葡萄糖浓度作为宿主细胞生长的指标（图6）。当中等葡萄糖浓度降至其起始浓度的50％时，必须补充新培养基以防止宿主细胞的损失。毛细血管外葡萄糖浓度保持恒定在约275 mg / dl（图6，虚线）。

图6.毛细血管内空间培养基的葡萄糖浓度每天监测向宿主细胞提供营养的培养基的葡萄糖浓度。在125ml烧瓶中起始浓度为350mg / dl，在第4天变为425mg / dl / 500ml烧瓶。当葡萄糖浓度在48小时内降至210-225mg / dl时（通常在第10天））在1L烧瓶中葡萄糖增加至475-500mg / dl。葡萄糖浓度通常在48小时内降至50％，因此在此后的周一，周三，周五时间表补充培养基。包含寄生虫的额外毛细血管空间中的葡萄糖保持恒定在275 mg / dl。

食谱

ECS中等混合

添加组分并对介质进行过滤灭菌。
*使用氮气脱气水制备，并在-20°C的氮气相下以1 ml等分试样储存。
＃库存保持在4°C
ICS中等混合

添加组分并将介质过滤灭菌。

致谢

我们要感谢Saul Tzipori博士和Sangun Lee博士（塔夫斯大学卡明斯兽医学院，美国马萨诸塞州N. Grafton）对体内动物研究的有益建议。博士的Louis Weiss和Leslie Gunther-Cummins（病理学和医学系，分析成像设施，Albert Einstein医学院，布朗克斯，纽约，美国）用于电子显微镜检查。这项工作由比尔和梅林达盖茨基金会（纽约）资助。该协议改编自Morada 等人（2016）。作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Arnold，SLM，Choi，R.，Hulverson，MA，Schaefer，DA，Vinayak，S.，Vidadala，RSR，McCloskey，MC，Whitman，GR，Huang，W.，Barrett，LK，Ojo，KK，Fan，E 。，Maly，DJ，Riggs，MW，Striepen，B。和Van Voorhis，WC（2017）。在治疗 Cryptosporidium 感染时，碰撞激酶抑制剂胃肠道暴露的必要性。 J Infect Dis 216（1）：55-63。
Arrowood，M。J.（2002）。 Cryptosporidium 物种的体外培养。 Clin Microbiol Rev 15（3）：390-400。
Arrowood，M。J.（2008）。体外培养。在： Cryptosporidium 和隐孢子虫病。 Fayer，R。和Xiao，L。（编辑）。 CRC Press ，Boca Raton：499-525。
Baydoun，M.，Vanneste，SB，Creusy，C.，Guyot，K.，Gantois，N.，Chabe，M.，Delaire，B.，Mouray，A.，Baydoun，A.，Forzy，G.，Chieux ，V.，Gosset，P.，Senez，V.，Viscogliosi，E.，Follet，J。和Certad，G。（2017）。成人小鼠结肠的三维（3D）培养体外隐孢子虫病模型：概念证明。 Sci Rep 7（1）：17288。
Bhutta，Z。A.和Black，R。E.（2013）。全球孕产妇，新生儿和儿童健康 - 如此接近但迄今为止。 N Engl J Med 369（23）：2226-2235。
Checkley，W.，White，AC，Jr.，Jaganath，D.，Arrowood，MJ，Chalmers，RM，Chen，XM，Fayer，R.，Griffiths，JK，Guerrant，RL，Hedstrom，L.，Huston，CD ，Kotloff，KL，Kang，G.，Mead，JR，Miller，M.，Petri，WA，Jr.，Priest，JW，Roos，DS，Striepen，B.，Thompson，RC，Ward，HD，Van Voorhis， WA，Xiao，L.，Zhu，G。和Houpt，ER（2015）。审查 Cryptosporidium的全球负担，新诊断，治疗和疫苗目标< / em>。 Lancet Infect Dis 15（1）：85-94。
DeCicco RePass，M。A.，Chen，Y.，Lin，Y.，Zhou，W.，Kaplan，D。L. and Ward，H。D.（2017）。用于长期感染隐孢子虫的新型生物工程三维人体肠道模型 parvum 。感染免疫 85（3）：e00731-16。
Kotloff，K.L。（2017）。发展中国家腹泻病的负担和病因。 Pediatr Clin North上午 64（4）：799-814。
Kotloff，KL，Nataro，JP，Blackwelder，WC，Nasrin，D.，Farag，TH，Panchalingam，S.，Wu，Y.，Sow，SO，Sur，D.，Breiman，RF，Faruque，AS，Zaidi， AK，Saha，D.，Alonso，PL，Tamboura，B.，Sanogo，D.，Onwuchekwa，U.，Manna，B.，Ramamurthy，T.，Kanungo，S.，Ochieng，JB，Omore，R.， Oundo，JO，Hossain，A.，Das，SK，Ahmed，S.，Qureshi，S.，Quadri，F.，Adegbola，RA，Antonio，M.，Hossain，MJ，Akinsola，A.，Mandomando，I。，Nhampossa，T.，Acacio，S.，Biswas，K.，O'Reilly，CE，Mintz，ED，Berkeley，LY，Muhsen，K.，Sommerfelt，H.，Robins-Browne，RM and Levine，MM（ 2013）。发展中国家婴幼儿腹泻病的负担和病因（全球肠道多中心研究， GEMS）：一项前瞻性病例对照研究。 Lancet 382（9888）：209-222。
Lang，D。和MAL-ED网络调查员。（2015年）。评估有助于发展中国家婴儿肠道微生物群发展的因素的机会。 Microb Ecol Health Dis 26：28316。
Love，M。S.，Beasley，F。C.，Jumani，R。S.，Wright，T。M.，Chatterjee，A.K.，Huston，C。D.，Schultz，P。G. and McNamara，C.W。（2017）。高通量表型筛选确定氯法齐明是隐孢子虫病的潜在治疗方法。 PLoS Negl Trop Dis 11（2）：e0005373。
Manjunatha，UH，Vinayak，S.，Zambriski，JA，Chao，AT，Sy，T.，Noble，CG，Bonamy，GMC，Kondreddi，RR，Zou，B.，Gedeck，P.，Brooks，CF，Herbert， GT，Sateriale，A.，Tandel，J.，Noh，S.，Lakshminarayana，SB，Lim，SH，Goodman，LB，Bodenreider，C.，Feng，G.，Zhang，L.，Blasco，F.，Wagner ，J.，Leong，FJ，Striepen，B。和Diagana，TT（2017）。 A Cryptosporidium PI（4）K抑制剂是隐孢子虫病的候选药物。自然 546（7658）：376-380。
Morada，M.，Lee，S.，Gunther-Cummins，L.，Weiss，L.M。，Widmer，G.，Tzipori，S。和Yarlett，N。（2016）。使用中空纤维技术连续培养 Cryptosporidium parvum 。 Int J Parasitol 46（1）：21-29。
Sow，SO，Muhsen，K。，Nasrin，D.，Blackwelder，WC，Wu，Y.，Farag，TH，Panchalingam，S.，Sur，D.，Zaidi，AK，Faruque，AS，Saha，D.， Adegbola，R.，Alonso，PL，Breiman，RF，Bassat，Q.，Tamboura，B.，Sanogo，D.，Onwuchekwa，U.，Manna，B.，Ramamurthy，T.，Kanungo，S.，Ahmed， S.，Qureshi，S.，Quadri，F.，Hossain，A.，Das，SK，Antonio，M.，Hossain，MJ，Mandomando，I.，Nhampossa，T.，Acacio，S.，Omore，R。，Oundo，JO，Ochieng，JB，Mintz，ED，O'Reilly，CE，Berkeley，LY，Livio，S.，Tennant，SM，Sommerfelt，H.，Nataro，JP，Ziv-Baran，T.，Robins- Browne，RM，Mishcherkin，V.，Zhang，J.，Liu，J.，Houpt，ER，Kotloff，KL和Levine，MM（2016）。儿童中隐孢子虫腹泻病的负担＆lt;利用全球肠道多中心研究（GEMS）的数据，在撒哈拉以南非洲和南亚的中度/高度死亡地区24个月。 PLoS Negl Trop Dis 10（5）：e0004729。
Vinayak，S.，Pawlowic，M。C.，Sateriale，A.，Brooks，C.F.，Studstill，C.J。，Bar-Peled，Y.，Cipriano，M。J. and Striepen，B。（2015）。腹泻病原体 Cryptosporidium parvum 的遗传修饰。 < em> Nature 523（7561）：477-480。
Zhang，H。和Zhu，G。（2015）。定量RT-PCR检测高通量筛选（HTS）药物对抗的生长>体外隐孢子虫。 Front Microbiol 6：991。