材料和试剂

携带敲入Nkx2.1基因座（Nkx2.1-GFP ESC）的GFP报告基因的小鼠ESC或iPSC（Longmire等人，2012）
1x 0.05％胰蛋白酶-EDTA（Life Technologies，Gibco ，目录号：25300-054）
定义的胎牛血清（Hyclone，目录号：SH30070.03）
IMDM粉末（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：12200-036）
NaHCO 3（Sigma-Aldrich，目录号：S-5761）
Pen/Strep（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：15140-148）（10,000U青霉素和10mg链霉素/ml）
Cellgro水（VWR，目录号：45000-672）
Ham's F-12（Cellgro，目录号：10-080-CV）
B-27补充RA（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：17504-044）
N-2补充剂（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：17502-048）
BSA中的7.5％BSA（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：15260-037）
1-硫代甘油（MTG）（Sigma，M6145-25ml）
200mM L-谷氨酰胺（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：25030-081）
抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A4544-25G）
1M HEPES（Gibco，15630-080）
CaCl 2（Sigma-Aldrich，目录号：C4901）
BSA（Sigma-Aldrich，目录号：A9418-10G）
100x ITS补充剂（BD Biosciences，目录号：354352）
mNoggin（R& D Systems，目录号：1967-NG-025）
SB431542（Sigma-Aldrich，目录号：S4317）
mRnt3a（R& D Systems，目录号：1324-WN-010）
hBMP4（R& D Systems，目录号：314-BP-050）
hEGF（R& D Systems，目录号：236-EG-01M）
mFGF2（R& D Systems，目录号：目录号：3139-FB-025）
mFGF7（R& D Systems，目录号：5028-KG-025）
hFGF10（R& D Systems，目录号：345-FG-025）
肝素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：H4784-250mg）
地塞米松（Sigma-Aldrich，目录号：D4902）
8-Br-cAMP（Sigma-Aldrich，目录号：B7880）
IBMX（Sigma-Aldrich，目录号：I5879）
DMSO，Hybri-Max（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
激活素A（R& D Systems，目录号：338-AC）
PBS（Life Technologies，Gibco ，目录号：14190-250）
0.1％明胶在超纯水（EMD Millipore，目录号：ES-006-B）中
Cxcr4抗体：APC大鼠抗小鼠CD184（Cxcr4）（BD-Pharmigen，目录号：558644）
cKit抗体：PE大鼠抗小鼠CD117（cKit）（BD-Pharmigen，目录号：553355）
APC同种型：APC大鼠IgG 2b，κ（BD-Pharmigen，目录号：553991）
PE同种型：PE大鼠IgG 2b，κ（BD-Pharmigen，目录号：553989）
IMDM（请参阅配方）
无血清分化培养基（SFD）（参见配方）
完全无血清分化培养基（cSFDM）（参见配方）
DCI + K的BASE介质（参见配方）
前置介质（参见配方）
中和介质（见配方）
DCI + K介质（见配方）
制备10x cAMP + IBMX储液（见配方）

设备

P100培养皿（100mm×15mm细菌培养皿，未处理的聚苯乙烯，BD Falcon ，目录号：351029）
P150培养皿（150mm×15mm细菌培养皿，未处理的聚苯乙烯，BD Falcon ，目录号：351058）
12×75mm，具有细胞过滤帽（BD，352235）的5ml聚苯乙烯圆底试管
1.5-ml Eppendorf Snap-Cap微量离心管（Thermo Fisher Scientific，目录号：05-402-25）
离心机
LSRII流式细胞仪
0.22μm过滤器

程序

时间线
1. 时间点：0小时
  1. Nkx2-1-GFP小鼠ESC或iPSC在2i_LIF（无血清，无饲养细胞）条件下培养。对于每个实验，将第23个通道的新小瓶解冻，并在两次传代后使用细胞
  2. 每个具有12.5ml /皿cSFDM的P100培养皿种子500,000Nkx2-1-GFP小鼠ESC或iPSC（悬浮液）。
  3. 在此期间，ESC或iPSC将形成100-300μm之间的将保持悬浮的胚状体（EB）。
2. 时间点：60小时
  1. 从一个盘中收集EB在一个50毫升锥形，让EB定居1-2分钟，小心删除大部分含有死细胞和碎片的上清液。
  2. 旋转5分钟，300×g <4℃，4℃
  3. 吸出上清液。
  4. 每管加入1ml 0.05％胰蛋白酶/EDTA，在37℃水浴中孵育1分钟，同时涡旋管。
  5. 通过温和研磨分解EB以形成单细胞悬浮液
  6. 加入1ml血清封闭胰蛋白酶
  7. 加入4ml IMDM。
  8. 旋转5分钟，300×g <4℃，4℃
  9. 将细胞重悬于5ml cSFDM中
  10. 计数单元格。
  11. 在每个P100或P150培养皿中，在补充有50ng/ml激活素A的25ml cSFDM中平板0.5-1×10 6个细胞（悬浮液），用于定形内胚层诱导和EB形成。
3. 时间点：120小时（第5天）
  1. 对替代定形内胚层标记物（Cxcr4/cKit，参见FACS方案）进行染色以证实有效的定形内胚层诱导（超过40-50％的细胞应该是Cxcr4 + sup/cKit ^sup>）。
  2. 收集EB并在IMDM中清洗。
  3. 旋转5分钟，300×g <4℃，4℃
  4. 重悬在10-15毫升前化培养基和板悬浮在新的P100培养皿
4. 时间点：144小时（第6天）
  1. 收集EB。
  2. 在IMDM中清洗。
  3. 旋转5分钟，300×g <4℃，4℃
  4. 通过胰蛋白酶消化1ml等份的EB以获得单个细胞并计算总细胞数当量来获得细胞计数。
  5. 重悬在腹侧培养基中
  6. 在明胶包被的平板或皿（例如24孔板的100,000 /孔）上涂布50,000个细胞/cm 2的EB当量。涂层程序参见下面的步骤2
  7. 每隔一天更换一次媒体。
  8. GFP ⁺将在第8-9天开始出现
5. 时间点：第15天
  1. 取出腹腔介质并加入适当体积的胰蛋白酶（例如，每孔6ml板1ml/P100皿3-4ml）。
  2. 转移细胞从50毫升锥形的几个井，通过温和研磨形成单细胞悬浮液，并与等体积的FBS灭活。
  3. 重悬于PBS ⁺（PBS + 2％FBS）中
  4. 排序GFP ⁺ cells。
  5. 旋转7分钟，500 x g ，4°C（注意离心机设置的变化）。
  6. 在补充有FGF2（250ng/ml），FGF10（100ng/ml）的cSFDM中复制25,000个细胞/cm 2（例如，24-孔板的50,000个细胞/ml）和肝素盐（100ng/ml）
  7. 每隔7天更换一次媒体。
6. 时间点：第22天
  1. 取出介质并用PBS冲洗。
  2. 切换到DCI + K媒体
  3. 在第25天收获细胞（程序与第15天相同）
明胶涂层
在室温下（例如在6孔板的孔中1ml）施加0.1％明胶（溶解在超纯水中）25-30分钟。吸出明胶，用PBS冲洗，并再次吸出。该板现在可以使用了。
Cxcr4/cKit的FACS
1. 细胞计数
  1. 取出1毫升EB，旋转和胰蛋白酶消化（0.5毫升胰蛋白酶），计数细胞
  2. 根据以前的细胞计数，去除对应于2-2.5×10 ⁶细胞的培养体积。
  3. 对未分化ES细胞重复步骤。
2. 制备用于染色的细胞（在冰上的所有步骤）
  1. 离心EB，重悬在1ml胰蛋白酶（60秒在37℃），用P1000移液管单分散。
  2. 用1ml血清灭活，离心（5分钟，300×g，4℃），并用5ml IMDM洗涤一次。
  3. 重悬于500μlPBS中（PBS + 2％FBS），细胞浓度应为0.4-0.5×10 6细胞/100μl。
  4. 准备2×5 Eppendorf管（未染色，同种型，Cxcr4，cKit，Cxcr4/cKit（双）），标记每个管系列（D5内胚层或未分化的ES细胞），并将100μl每种培养物转移到每个管。
3. 细胞染色
  1. 每管加入合适的抗体（例如，在"未染色"管中没有抗体，"双"管中的两种抗体）。
    用于此协议的抗体为08/15/12：
    同种型：APC大鼠IgG 2b，κ
    同种型：PE大鼠IgC 2b，κ
    Cxcr4：APC大鼠α - 小鼠CD184
    cKit：PE鼠α小鼠CD117
  2. 短暂涡旋并在冰上转移30分钟（用铝箔覆盖，在15分钟再次涡旋）
  3. 每个管中加入1ml PBS ，在台式离心机中以300×g旋转5分钟，小心地吸出上清液。
  4. 在500μlPBS ^{+中重悬沉淀。}
  5. 转移到带有细胞过滤器帽的FACS聚苯乙烯管
  6. 将细胞送到LSRII进行分析。

食谱

IMDM
1包IMDM粉末
3.02g NaHCO 3/v/v 10ml Pen/Strep
1 L Cellgro水
检查pH（可接受范围6.9≤pH≤7.3）
无血清分化培养基（SFD）
IMDM-375 ml
火腿的F-1-125毫升
B-27补充RA-5 ml
N-2补充-2.5毫升
BSA 7.5％的PBS-3.3ml
完全无血清分化培养基（cSFDM）
SFD -100 ml
MTG300μl储备液（库存：26μlMTG至2ml IMDM）
200 mM L-Glut -1 ml
抗坏血酸-1ml原液（库存：5mg/ml蒸馏水，新鲜制备）
DCI + K的BASE介质
Ham's F-12-243.7 ml
1.0 M HEPES（pH 7.4）-3.75 ml
1.0M CaCl 2-200μl
BSA-0.625g
100x ITS补充-2.5毫升
前置媒介
cSFDM-10 ml
mNoggin-100ng ml（储备：10μg/ml） SB431542-10μM（储备液：10mM，在DMSO中）
中和介质
cSFDM - 10ml
mWnt3a-100ng/ml（储备：100μg/ml） hBMP4-10ng/ml （储备：10μg/ml） hEGF-20ng/ml（储备：20μg/ml） mFGF2-250ng/ml（储备：100μg/ml） mFGF7-10ng/ml（储备：10μg/ml） hFGF10-10ng/ml（储备：10μg/ml）肝素钠盐-100ng/ml血浆（储备液：1mg/ml）
DCI + K介质
BASE培养基 - 25 ml
地塞米松-50nM（储备液：250μM，在乙醇中）
KGF（FGF7）-10ng/ml（储备：10μg/ml） cAMP + IBMX-0.1mM（储备液：1mM cAMP + 1mM IBMX）
制备10x cAMP + IBMX公司
将22.22mg IBMX溶于1ml DMSO（0.1M IBMX储备液，-20℃储存）中
为了制备1mM cAMP + 1mM IBMX（10x）原液，将21.5mg 8BrcAMP溶解在49.5ml BASE培养基中，并加入0.5ml IBMX贮液器
0.22μm过滤器
在4°C下存储最多4周

致谢

该协议最初作为以下文件的一部分发布：Longmire等人（2012）。作者希望感谢Kotton实验室的所有成员进行有益的讨论和编辑。 DNK由NIH PO1 HL047049-16A1,1RC2HL101535-01，1R01 HL095993-01，1R01 HL108678，USAMRRA奖，Alpha-1基金奖和波士顿大学Evans交叉研究中心ARC奖提供支持。 TAL由NIH培训补助T32 HL007035支持。 LI由R01 HL111574和ATS/ChILD基金会奖励。

参考文献

Gonzales，L.W.，Guttentag，S.H.，Wade，K.C.，Postle，A.D.and Ballard，P.L。（2002）。通过糖皮质激素加cAMP在体外分化人类肺II型细胞。 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 283（5）：L940-951.
长期以来，我们的研究结果表明，该方法可以有效地降低血液中的葡萄糖浓度， Serra，M.，Weiss，DJ，Green，MD，Snoeck，HW，Ramirez，MI和Kotton，DN（2012）。从胚胎干细胞高效地推导纯化的肺和甲状腺祖细胞。细胞干细胞 10（4）：398-411。
Wray，J.，Kalkan，T.，and Smith，A.G。（2010）。用干细胞技术革新药物发现。 Biochem Soc Trans。38，1027-1032。