材料和试剂

移液器吸头
白色96孔板（CELLSTAR ®组织培养板，Greiner Bio One International，目录号：655083）
HEK293（293 [HEK-293]; ATCC，目录号：CRL-1573）
pLightswitch_Prom_BMX（BMX启动子构建; SwitchGear Genomics，目录号：S701154）
pLightswitch_Prom控制向量（SwitchGear Genomics，目录号：S790005）
pTK-Cluc（Cypridina TK control construct; SwitchGear Genomics，目录号：SN0322S）
FuGENE ® HD（Promega，目录号：E2311）
DMEM，高葡萄糖，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11995065）
QuikChange XL定点诱变试剂盒（安捷伦科技，目录号：200516）
极好的肉汤粉（BD，Difco TM ，目录号：243820）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G9012）
聚-D-赖氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：P6407-5MG）
Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：31985070）
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10437028）
LightSwitch双分析系统（SwitchGear Genomics，目录号：DA010）
Poly-D-Lysine hydrobromide（MP Biomedicals，目录号：02150175）
极好的肉汤（见食谱）
5x聚-D-赖氨酸溶液（见食谱）
1x聚-D-赖氨酸溶液（无菌）（见食谱）
增长媒体（见食谱）

设备

移液器
热循环仪（Eppendorf，型号：Mastercycler ® pro S，目录号：950030020）
台式离心机（Eppendorf，型号：5810 R，目录号：022625101）
摆动斗转子（Eppendorf，型号：S-4-104，目录号：5820755008）
高性能离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM RC 6 Plus，目录号：36-101-0816）
层流罩（赛默飞世尔科技，型号：1300系列II级，A2型，目录号：1323TS）
37°C，5％CO 2 水套式培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：Heracell VIOS 160i，目录号：51030285）
37°C非加湿培养箱（Labnet International，型号：311DS，目录号：I5311-DS）
缺氧室（Coy Lab，型号：O 2 Control InVitro Glove Box，无升级）
1. 加湿孵化盒
2. 温度控制
3. 以0.1％的增量控制O 2 和CO 2
平板发光计（Molecular Devices，型号：SpectraMax i3x，无升级版）
标准功能包括：
1. 读取模式：吸光度，荧光，发光
2. 波长范围包括：Abs：230-1,000nm，Fl Ex：250-830nm，Fl EM 270-850nm，Lumi：300-850nm

软件

GraphPad Prism（GraphPad软件，版本6）
QuikChange Primer Design（ https://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp ）

程序

pLightswitch_Prom_BMX的定点诱变突变BMX启动子内的推定HRE
1. 设计引物以使用QuikChange Primer Design网站（参考上文）突变BMX启动子的HRE内的2个碱基对（A CG或TG A→TG）。
  文献中已经描述了CG→TA bp的变化，以有效地破坏HRE。
2. 每个制造商使用 QuikChangeXL定点诱变试剂盒对pLightSwitch_Prom_BMX进行突变协议。
  1. 延长时间：4.5分钟
  2. 用于NZY + 肉汤的替代Difco TM 极好的肉汤
3. 通过使用Switchgear Genomics网站上列出的启动子插入测序引物（正向：5'-TCCATCAAAACAAAACGAAACAA-3'，反向：5'-AGTCGAGCACGTTCATCTGCTT-3'）测序来确认突变质粒（ http://switchgeargenomics.com/resources/vector-maps ）。
缺氧报告基因检测（ LightSwitch双重检测系统手册）
第1天（在Laminar流罩下进行）
1. 在室温下将两个白色96孔板与1x聚-D-赖氨酸（50μl/孔）一起涂覆2小时。
  1. 每板镀足够的孔，一式三份进行。
  2. 示例示例：
    1. 空载体（pLightSwitch_Prom）+ pTK-Cluc
    2. 野生型Bmx启动子（pLightSwitch_Prom_BMX）+ pTK-Cluc
    3. HRE突变BMX启动子（pLightSwitch_Prom_BMXmHRE）+ pTK-Cluc＆nbsp;
  3. 每种条件使用一个平板（即，2个平板用于比较常氧和缺氧）。
2. 用无菌H 2 O（200μl/孔）洗涤板一次;在100μl生长培养基中每孔培养5×10 3个 3 HEK293细胞，并在37℃，5％CO 2 中培养过夜。
第2天
构建体和试剂的制备
1. 让所有试剂和质粒平衡至室温。
  注意：质粒应使用可去除内毒素的试剂盒或方案进行纯化，例如Promega的PureYeild Plasmid System。
2. 预热Opti-MEM至37°C。
转染（在Laminar流罩下进行）
1. 根据协议细节（LightSwitch Dual Assay System;链接到上面找到的方案）进行96孔板的转染，只需极少的改变。
  Cypridina TK对照构建体，pTK-Cluc：1 ng（由于荧光素酶饱和，使用1纳克代替10 ng）
  pLightSwitch_Prom，pLightSwitch_Prom_BMX或pLightSwitch_Prom_BMXmHRE：30 ng
  FuGENE ® HD与质粒的比例：3：1（0.3μlFuGENE：每孔100 ng DNA）
2. 简言之，转染方案是：
  1. 如下表所示混合试剂并充分混合。
  2. 我们坐在室温下30分钟。
  3. 轻轻地落在种子井上。
  4. 轻轻摇晃。
  5. 平板应在常氧（5％CO 2 ）中于37℃温育24小时。
第3天（在层流罩下）
1. 通过更换两个平板上的介质来移除转染试剂。
2. 在37°C将一个平板转移到缺氧（5％CO 2 ，94％N 2 和1％O 2 ）并维持另一个一个在常氧中。
3. 将两个平板孵育24小时。
  注意：孵化时间可能因缺氧导致您喜欢的基因的诱导率而异。
第4天
按照制造商的说明（ LightSwitch Dual Assay System ）测量Renilla（pLightSwitch_Prom载体）和Cypridina （pTK-Cluc）荧光素酶活性。
1. SwitchGear Genomics详细描述的协议没有改变。板材总是新鲜测量，从不冷冻。
2. 对于缺氧条件（均在缺氧室内完成）：
  1. 添加试剂和孵育都在缺氧室内完成。
  2. 从缺氧处移除平板并立即在平板读数器上读取发光。
3. 对于常氧条件：添加试剂和孵育均在室温下在工作台上进行。

数据分析

将Renilla（pLightSwitch_Prom）荧光素酶活性标准化为Cypridina（pTK-Cluc）荧光素酶活性，并针对每种条件调整背景荧光素酶。
然后可以将数据绘制为相对荧光素酶活性或倍数变化（见图1）
注意：如果确定倍数变化，则应在常氧条件下与野生型启动子进行比较。

图1.示例数据

笔记

虽然从实验到实验的转染效率可能存在差异，但LightSwitch Dual Assay系统旨在通过减少外来影响来提高实验准确性。因此，在将海肾荧光素酶活性标准化为Cypridina荧光素酶活性后，您的重现性和可变性应该是最小的。

食谱

很棒的肉汤
47.6克极好的肉汤粉
4毫升甘油
1 L H 2 O
在121°C高压灭菌15分钟
5x聚-D-赖氨酸溶液
将5mg聚-D-赖氨酸溶解在1L ddH 2 O中
1x聚-D-赖氨酸溶液（无菌）
用800 ml ddH 2 O稀释200 ml 5x聚-D-赖氨酸溶液w并过滤灭菌
成长媒体
DMEM
10％FBS

致谢

我们感谢Navjotsingh Pabla在协稿开发方面的帮助以及稿件准备期间的有益评论。该研究得到了美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构，NIH癌症中心支持补助金P30 CA021765和R01 CA138744（致SDB）的支持。该研究还得到了俄亥俄州立大学综合癌症中心，Pelotonia基金会和NIH癌症中心支持基金P30 CA016058的资助。作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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