材料和试剂

0.2μm过滤器
细菌培养皿（Fisher Scientific，目录号：FB0875712）
无菌试管（17 x 100 mm，RPI，Research Products International，目录号：168599）
血清移液器：
5毫升移液器（SARSTEDT，目录号：86.1253.001）
25毫升移液器（SARSTEDT，目录号：86.1685.001）
Nalgene TM 2 ml低温管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号5000-0020）
Coverglasses，22 x 22 mm（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：12-542B）
Nunc TM 6孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：150239）
铝箔
显微镜载玻片（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：12-552-3）
无菌一次性塑料材料：
Posi-Click管（Denville Scientific，目录号：C2170）
P200和P1000提示（USA Scientific，目录号：1111-0706和1112-1720）
B中。含有pGB5P1-GFP质粒的百日咳菌株
去纤维羊的血液（Hemostat Laboratories，目录号：DSB100）
50％甘油溶液（Fisher Scientific，目录号：G33-1）
卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K1377）
中和缓冲福尔马林（Fisher Scientific，目录号：SF100-4）
Stainer-Scholte中等（Stainer et al。，1970; Nicholson et al。，2012）
无菌PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14190144）
ProLong TM Gold Antifade Mountant（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：P36934）
Difco TM Bordet-Gengou琼脂平板（BD，BD Biosciences，目录号：248200）
L-脯氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：131547）
KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：V000225）
KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P3911）
MgCl 2 ·6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2393）
CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：C1016）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1378）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
FeSO 4 ·7H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：F8633）
L-胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：C8755）
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5960）
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1276）
还原型L-谷胱甘肽（Sigma-Aldrich，目录号：G4251）
SS介质（见食谱）
SS补充剂（过滤灭菌）（见食谱）
Bordet-Gengou（BG）培养基（参见食谱）

设备

Kimax ® Erlenmeyer烧瓶（125 ml）（DWK Life Sciences，KIMBLE ®，目录号：26500）
无菌镊子
PIPETMAN ® Classic（Gilson，型号：P20，P200，P1000，目录号：F123600，F123601，F123602）

化学通风橱（Hamilton Laboratory Solutions，型号：PL-822）
Eclipse Ti-E倒置共聚焦显微镜（尼康，型号：D-Eclipse C1si）
Vortex（Fisher Scientific，目录号：02-215-365）
pH计（丹佛仪器，型号：UB-10）
培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：Forma TM Steri-Cycle TM ）
台式离心机（Eppendorf，型号：5418）
冰箱（4°C）（惠而浦，型号：WRR56X18FW02）
-20°C冰箱（Kenmore，型号：253-26722103）
SPECTRONIC TM 分光光度计（赛默飞世尔科技，型号：GENESYS 20）
称重秤（Ohaus，型号：Scout Pro SP202和VWR，型号：VWR-164AC）
滚筒（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：TC-2）

软件

ImageJ（Schneider et al。，2012）
COMSTAT2插件（Heydorn et al。，2000）

程序

注意：

整个协议如图1所示。
在实验过程中应避免样品光照。在所有情况下，培养基补充适当的抗生素以维持编码GFP的质粒。

图1.用于增长 B的示意性逐步协议。用于CLSM评估的百日咳生物膜

B的成长。百日咳菌株
1. 从储存在-78°C的冷冻原料中，条纹 B.含有GFP编码质粒的百日咳菌株，在该方案中使用pGB5P1-GFP（Weingart et al。，1999），在Bordet-Gengou琼脂平板上添加10％去纤维蛋白的绵羊血液和25μg/ ml的卡那霉素。将板在37℃孵育4-5天。
2. 挑取单个菌落（~8-10）并接种2ml补充有25μg/ ml卡那霉素的Stainer-Scholte（SS）液体培养基。在37°C下在滚筒中以最高速度旋转孵育24小时。
3. 用来自步骤A2的培养物接种30ml补充有25μg/ ml卡那霉素的SS培养基（在100ml锥形瓶中），以达到OD <650> 0.2。在37℃下以160rcf振荡孵育12小时。
体外生物膜形成
1. 在无菌6孔板的底部插入无菌盖玻片（火焰灭菌）。
2. 通过稀释 B来制备接种物。百日咳培养（方法A，步骤3）至SS培养基中的OD 650 为1.0。将1.5ml接种物吸移到6孔板的各个孔中。确保细菌悬浮液覆盖盖玻片的整个表面。如果使用其他基材（即，聚碳酸酯或铝试样），应根据材料的厚度调整体积。
3. 盖上平板并在加湿室中静置孵育4小时，温度为37°C。
  注意：此步骤可使细菌粘附在表面上。
4. 在不干扰附着细胞的情况下小心移除接种物（以便去除未附着的浮游细菌）并添加约800μl新鲜SS培养基，沿着孔壁分配以防止生物膜破坏。将板放置在相对于水平方向成30°-50°的角度，在盖玻片中形成气液界面，生物膜将在此处形成。用铝箔盖住平板，在平板振荡器上以37°C的温度在90 rcf的湿润室中孵育。
5. ＆nbsp;如果要检查生物膜形成超过24小时，如上所述每24小时更换一次培养基。样品可在24,48和72加工至96小时。
生物膜的可视化
1. 每个时间点后，从每个孔吸出培养基，用无菌PBS仔细清洗生物膜两次。
2. 用镊子将盖玻片取出并放入新的6孔板中。可以使用针来帮助提升盖玻片，然后使用镊子拾取盖玻片而不接触生物膜发展的区域。
3. 小心地加入50μl中性缓冲福尔马林，或足以覆盖玻璃表面。必须特别注意不要打扰生物膜并在室温下孵育15分钟。
4. 取出固定剂，用PBS洗两次。
5. 用镊子盖上盖玻片，然后使用ProLong TM Gold安装介质安装到载玻片上。或者，如果细菌没有用荧光蛋白标记，可以在此时用荧光染料染色细胞然后进行染色。
6. 通过在4°C温育24小时，使安装介质硬化。
7. 载玻片可以在室温下在黑暗中储存（数周至数月），以便以后可视化。用共聚焦显微镜检查样品，以z-堆叠配置拍摄图像，确保从下到上覆盖整个生物膜结构。
8. 使用显微镜图像可视化软件分析图像（图2）。
  
  图2. B的显微照片。百日咳生物膜。生物膜从24小时生长至96小时，并且在倒置共聚焦显微镜中以z-堆叠设置获得图像。图像以xy，xz和yz平面显示。

数据分析

使用在ImageJ中运行的COMSTAT2插件（Heydorn 等人，2000）可以获得来自图像的定量数据（Schneider 等人，2012）。可以分析的结构特征是最大和平均厚度，基底覆盖率，生物量和粗糙度系数（参见表1 中的结构数据）。有关COMSTAT2使用的详细说明，请参阅Heydorn et al。（2000）。应对获得的数据进行适当的统计分析。

表1.使用COMSTAT2软件获得的图2中生物膜结构特征

笔记

由于用该测定观察到的变化，需要进行每个样品的重复和至少三次独立的重复。对于每个样本，应至少获取三个代表性图像。
重要的考虑因素不是破坏附着在玻璃表面上的生物膜。取决于微生物，细胞可以强烈地或松散地附着于表面。因此，在分配液体时要非常小心，以避免强剪切力，这一点很重要。
BG-琼脂培养基和SS培养基通过在121℃高压灭菌15分钟进行灭菌。
为了制备低温原料，应使用培养至指数期的培养物（如步骤A2中所述设置）。使用无菌2 ml低温管并将500μl细菌培养物与500μl无菌50％甘油溶液混合。储存在-78°C。

食谱

注意：除非另有说明，否则所有储备溶液均使用Milli Q水制备。

SS媒体
谷氨酸钠：10.70克/升
L-脯氨酸：0.24克/升
KH 2 PO 4 ：0.5g / L
KCl：0.20克/升
MgCl 2 ·6H 2 O：0.20 g / L
CaCl 2 ：0.2g / L
Tris碱：1.52克/升
NaCl：2.50克/升
用HCl调节pH至7.3-7.4
SS补充剂（0.2μm过滤灭菌）
溶于HCl浓缩，然后过滤消毒
FeSO 4 ·7H 2 O：10 mg / L
L-胱氨酸：40 mg / L
L-抗坏血酸：20 mg / L
烟酸：4 mg / L
还原型L-谷胱甘肽：100 mg / L
Bordet-Gengou（BG）媒体
Difco TM Bordet-Gengou琼脂（30 g / L）
20毫升50％甘油
在121°C高压灭菌15分钟
在45-50°C无菌添加15％无菌去纤维蛋白血液
混合均匀和盘子

致谢

该项目的资金部分来自国家过敏和传染病研究所，国立卫生研究院，卫生和人类服务部的联邦资金，资助金额为1R21AI123805-0和R01AI125560。
该方案改编自Cattelan，N.，Jennings-Gee，J.，Dubey，P.，Yantorno，O.M。和Deora，R。（2017）。百日咳博德特氏菌菌株形成的高生物膜与增强的毒力性状相关。感染免疫 85（12）。
作者宣称没有利益冲突。

参考

Cattelan，N.，Dubey，P.，Arnal，L.，Yantorno，O。M.和Deora，R。（2016）。 Bordetella 生物膜：导致持续感染的生活方式。 Pathog Dis 74（1）：ftv108。
Cattelan，N.，Jennings-Gee，J.，Dubey，P.，Yantorno，O。M. and Deora，R。（2017）。百日咳博德特氏菌菌株形成的高生物膜与增强的毒力特性相关。感染免疫 85（12）。
Conover，M。S.，Mishra，M。和Deora，R。（2011）。细胞外DNA对于维持非生物表面上的 PLoS One 6（2）：e16861。
Conover，M。S.，Sloan，G.P.，Love，C.F.，Sukumar，N。和Deora，R。（2010）。百日咳博德特氏菌的Bps多糖可促进鼻腔内的定植和生物膜形成通过作为粘附素起作用。 Mol Microbiol 77（6）：1439-1455。
Dorji，D.，Mooi，F.，Yantorno，O.，Deora，R.，Graham，R.M。和Mukkur，T.K。（2018）。博德特氏菌百日咳毒力因子在百日咳疫苗的持续发展中得到改善性能。 Med Microbiol Immunol 207（1）：3-26。
Ganguly，T.，Johnson，J.B.，Kock，N.D.，Parks，G.D。和Deora，R。（2014）。 Bordetella pertussis Bps多糖通过赋予补体保护来增强肺部定植介导的杀戮。细胞微生物 16（7）：1105-1118。
Heydorn，A.，Nielsen，A.T.，Hentzer，M.，Sternberg，C.，Givskov，M.，Ersboll，B.K。和Molin，S。（2000）。新型计算机程序COMSTAT对生物膜结构进行定量分析。微生物学 146（Pt 10）：2395-2407。
Mishra，M.，Parise，G.，Jackson，K.D.，Wozniak，D。J. and Deora，R。（2005）。 BvgAS信号转导系统调节 Bordetella 中的生物膜发育。 J Bacteriol 187（4）：1474-1484。
Mooi，F。R.（2010）。 Bordetella pertussis 和疫苗接种：基因单形病原体的持续存在。< / a> 感染Genet Evol 10（1）：36-49。
Nicholson，T.L。，Conover，M。S.和Deora，R。（2012）。转录组分析揭示了在支气管炎博德特氏菌生物膜发育过程中阶段特异性生产和鞭毛的需求< / em>。 PLoS One 7（11）：e49166。
Parise，G.，Mishra，M.，Itoh，Y.，Romeo，T。和Deora，R。（2007）。推定的多糖基因座在 Bordetella 生物膜开发中的作用。 J Bacteriol 189（3）：750-760。
Schneider，C.A.，Rasband，W。S.和Eliceiri，K.W。（2012）。 NIH Image to ImageJ：25年的图像分析。 Nat Methods < / em> 9（7）：671-675。
Serra，D.O.，Conover，M。S.，Arnal，L.，Sloan，G.P.，Rodriguez，M.E.，Yantorno，O。M. and Deora，R。（2011）。 FHA介导的细胞 - 基质和细胞 - 细胞粘附对百日咳博德特氏菌至关重要在非生物表面以及小鼠鼻子和气管中形成生物膜。 PLoS One 6（12）：e28811。
Serra，D.O.，Lucking，G.，Weiland，F.，Schulz，S.，Gorg，A.，Yantorno，O。M.和Ehling-Schulz，M。（2008）。蛋白质组学方法与傅里叶变换红外光谱相结合，揭示了百日咳博德特氏菌中独特的生物膜生理学。蛋白质组学 8（23-24）：4995-5010。
Sloan，G.P.，Love，C.F.，Sukumar，N.，Mishra，M。和Deora，R。（2007）。 Bordetella Bps多糖对小鼠呼吸道生物膜发育至关重要。 J Bacteriol 189（22）：8270-8276。
Stainer，D。W.和Scholte，M。J.（1970）。用于生产I期百日咳博德特氏菌的简单化学成分确定培养基。 J Gen Microbiol 63（2）：211-220。
Sukumar，N.，Love，C.F.，Conover，M。S.，Kock，N.D.，Dubey，P。和Deora，R。（2009）。使用 Bordetella 定植因子A进行主动和被动免疫可保护小鼠免受呼吸系统攻击与支气管炎博德特氏菌。感染免疫 77（2）：885-895。
Weingart，C.L.，Broitman-Maduro，G.，Dean，G.，Newman，S.，Peppler，M。和Weiss，A.A。（1999）。荧光标记影响人嗜中性粒细胞对百日咳博德特氏菌的吞噬作用。感染免疫 67（8）：4264-4267。