材料和试剂

移液器吸头（例如，PIPETMAN Diamond Tips，Gilson）
无针注射器（例如，Terumo TM Tuberculin Syringes 1 ml，Terumo Medical，目录号：SS-01T）
50毫升管（例如，50毫升Falcon离心管）
200毫升圆底烧瓶
2毫升管（例如，微量离心管，2毫升带盖，品牌，目录号：780550）
4-5周龄野生型或基因沉默的 Nicotiana benthamiana
注意：
1. 对于本塞姆氏烟草的病毒诱导的基因沉默（VIGS），见Zhang和Liu，（2014）。
2. 类似的方法可以应用于其他植物物种（例如，见Khare等，2017）。
INF1激发子由 P产生。大批出没或 E。大肠杆菌
注意：
1. 关于INF1制备的方法，参见Takemoto等。（2005）或Shibata等。（2010）。
2. 也可以使用其他引发器。＆nbsp;
Capsidiol
注意：Capsidiol不可商购。关于衣壳醇纯化的方法，参见Matsukawa等人。（2013）。
99.5％环己烷（Wako Pure Chemical Industries，目录号：034-05006）
99.5％环己烷/乙酸乙酯（1：1，v / v）（乙酸乙酯，Wako Pure Chemical Industries，目录号：051-00351）
99.5％乙腈（Wako Pure Chemical Industries，目录号：019-08631）
液氮
甲醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：131-01826）

设备

移液器（例如，PIPETMAN P，Gilson）
电子秤（例如，Mettler-Toledo International，型号：AG245分析天平）
冰柜
带水浴的旋转蒸发器（例如，Yamato Scientific，型号：RE-301-BW）
离心浓缩器（例如，TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：CC-105带真空泵）
微管混合器（例如，TAITEC，型号：E-36）
Sonicator Bath（例如，SND，型号：US-101）
砂浆和杵
微量离心机（例如，KUBOTA，型号：3740）
高效液相色谱（HPLC）系统（例如，Prominence Modular HPLC system，Shimadzu，Japan）
ODS专栏（例如，Nomura Chemical，型号：Develosil ODS-UG-3）

程序

诱导子的处理和 N的细胞外代谢产物的制备。本生的叶子
1. 通过使用无针注射器将溶液注射到叶的远轴侧的细胞内空间中，用150nM INF1激发剂溶液处理本塞姆氏烟草叶（图1A）。在渗透过程中施加轻微的压力，以避免损坏叶组织。在5-10个位置注入溶液以确保叶子的充分覆盖。在光照下在23°C孵育9小时。
2. 切断植物的处理过的叶子（图1B）并使用电子秤测量每片叶子的重量（一般来说，中等大小的叶片约为1克）。
  注意：一次处理一个叶子的步骤A2到A4。
3. 将每片叶子放入50ml管中（图1C）。避免中央静脉破裂。
4. 洗涤步骤：加入约。每管50ml环己烷。轻轻摇晃约在室温下30秒（图1D），然后将环己烷倒入200ml圆底烧瓶（或新鲜的50ml管中以储存在冰箱中）中以收集叶表面上的环己烷可溶性代谢物。冷冻并将叶组织保持在相同的50 ml管中，以便稍后提取细胞内（组织内）代谢物（参见程序B中的步骤）。
  
  图1.诱导子的处理和 N的细胞外代谢物的制备。通过无针注射器将溶液注入叶子的细胞内空间来处理诱导子。 A. B.从植物上切下处理过的叶子。 C.将每片叶子放入50ml管中。 D.添加约。 50毫升环己烷，轻轻摇动约。 30秒。
  注意：摇动的时间可能更长（例如，几分钟），但确定所有样品的时间非常重要。测试叶绿素泄漏到环己烷中以确保环己烷对叶细胞没有严重损害。有关详细信息，请参阅Shibata等，2016。
5. 使用旋转蒸发器（在水浴中在约40℃下）蒸发步骤A4中获得的环己烷。
6. 为了收集在圆底烧瓶底部干燥的代谢物，用移液管用1ml环己烷/乙酸乙酯（1：1，v / v）洗涤底部两次，并将溶液（总共2ml）收集到2中。毫升管。
  注意：在加入溶剂之前，让烧瓶冷却至室温。
7. 使用离心浓缩器蒸发2 ml管中的溶剂（此步骤通常需要约1小时）。
8. 将沉淀重新溶解在100μl乙腈中，充分混合并加入50μlddH 2 O。
9. 使用微管混合器将2ml管充分摇动5分钟。
10. 通过将管在超声波浴中漂浮5分钟来超声处理样品。
11. 在室温下以16,000 x g 离心1分钟并收集上清液。
  注意：小心收集120μl上清液，以避免沉淀物污染。
12. 通过HPLC分析代谢物。见程序C.
制备 N的细胞内（组织内）代谢物。本生的叶子
1. 研磨 N的叶子。来自步骤A4的本塞姆氏菌在液氮中用研钵和研杵，并悬浮在50％甲醇（1ml / 300mg叶组织）中。
2. 在室温下以16,000 x g 离心1分钟并收集上清液。
3. 加入相同体积的环己烷/乙酸乙酯（1：1，体积/体积）并涡旋。
4. 在室温下以3,000 x g 离心5分钟，并收集上层相（乙酸乙酯层）。
5. 使用离心浓缩器蒸发溶剂。（这一步通常需要约1小时）。
6. 将沉淀重新溶解在100μl乙腈中并加入50μlddH 2 。
7. 用微管混合器摇匀2毫升，5分钟。
8. 通过在超声波浴中漂浮管5分钟来超声处理样品。
9. 在室温下以16,000 x g 离心1分钟并收集上清液。
  注意：小心收集120μl上清液以避免沉淀物污染。
10. 通过HPLC分析代谢物。见程序C.
高效液相色谱（HPLC）分析
来自程序A和B的样品在以下条件下进行HPLC分析。
注意：可能会使用其他条件，但这会影响产品的洗脱时间。
专栏：ODS专栏（例如，Develosil ODS-UG-3，Nomura Chemical，日本）。
溶剂：50％乙腈（0至3分钟），从50％至80％乙腈（3至13分钟）线性增加，以及80％至100％乙腈（13至14分钟）。
注射量：5μl。
流速：1.0毫升/分钟。
在205nm处检测。
Capsidiol和Capsidiol 3-acetate分别在4.6和12.8分钟洗脱（参见图2）。使用峰面积进行定量分析。
注意：关于衣壳菌-3-乙酸酯纯化的方法，请参见Matsukawa等。（2013）。

图2. TRV感染或Nb- ABCG1 / 2 - 沉默 N的细胞外代谢物的洗脱曲线。用150nM INF1处理TRV感染的（A）或 NbABCG1 / 2 - 沉默的植物（B）的叶子。通过HPLC分析洗涤液的洗脱曲线（在205nm处检测）。

数据分析

首先测试纯化的衣壳二醇用于HPLC分析，以确定每个量的衣壳醇的峰面积评分，以及在实验条件下衣壳二醇的洗脱时间。
通过比较由来自相同叶片的方法A和B制备的样品中检测到的衣壳二醇的量来计算分泌的/细胞内衣壳二醇的比例。
比较野生型和转运缺陷基因沉默的 N之间衣壳二醇的分泌。 benthamiana ，比较 N之间细胞外代谢物的洗脱曲线。本哈台那条线。参见图1中所示的实例，用于可能的衣壳体转运蛋白NbABCG1 / 2的基因沉默。其他代谢物的峰可用作内标，以确保一致的提取（洗涤）效率。

笔记

对照 N的分泌/细胞内衣壳二醇的比例。在我们的实验条件下，用150nM INF1处理9小时的本塞姆氏叶在1.5-2.5左右。该比例将受到诱导子活动（批次间差异），采样时间点和叶片年龄等因素的影响。因此，确定实验条件非常重要。
避免使用诱导叶片组织细胞死亡的诱导子，因为细胞死亡会导致细胞内代谢物的泄漏。

致谢

我们感谢Makoto Ojika教授（日本名古屋大学）提供技术建议。这项工作得到了日本科学促进会的科学研究资助（B）（26292024和17H03771）的支持。没有披露潜在的利益冲突。

参考

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Khare，D.，Choi，H.，Huh，S.U.，Bassin，B.，Kim，J.，Martinoia，E.，Sohn，K.H.，Paek，K.H。和Lee，Y。（2017）。拟南芥ABCG34通过调节camalexin的分泌，有助于防御坏死性病原体。 Proc Natl Acad Sci USA 114（28）：E5712-E5720。
Matsukawa，M.，Shibata，Y.，Ohtsu，M.，Mizutani，A.，Mori，H.，Wang，P.，Ojika，M.，Kawakita，K。和Takemoto，D。（2013）。乙烯介导的植物抗毒素生产需要 Nicotiana benthamiana 钙网蛋白3a和卵菌病原体 Phytophthora infestans 的抗病性。 Mol Plant Microbe Interact 26（8）：880-892。
Shibata，Y.，Kawakita，K。和Takemoto，D。（2010）。 Nicotiana benthamiana 对抗半生物致病菌的年龄相关抗性 Phytophthora大肠杆菌需要乙烯和水杨酸介导的信号通路。 Mol Plant Microbe Interact 23（9）：1130-1142。
Shibata，Y.，Ojika，M.，Sugiyama，A.，Yazaki，K.，Jones，D.A.，Kawakita，K。和Takemoto，D。（2016）。全尺寸ABCG转运蛋白Nb-ABCG1和Nb-ABCG2在入侵前后的防御功能 Phytophthor Nicotiana benthamiana 中的致病菌。植物细胞 28（ 5）：1163-1181。
Sugiyama，A.，Shitan，N。和Yazaki K.（2007）。大豆ATP结合盒型转运蛋白参与豆科植物分泌染料木黄酮 - 一种信号类黄酮 - Rhizobium 共生。植物生理学 144（4）：2000-2008。
Takemoto，D.，Hardham，A.R。和Jones，D.A。（2005）。 Phytophthora elicitins诱导细胞死亡的差异由下游信号成分决定MAP激酶激酶在不同种类 Nicotiana 和 Brassica rapa 和 Raphanus sativus 的品种中的应用。植物生理学 em> 138（3）：1491-1504。
Zhang，H。和Liu，Y。（2014）。 VIGS分析。生物协议 4（5）：e1057。