材料和试剂

注意：

我们在独立实验中测试了所有组件。但是，这个清单并不意味着其他制造商的替代产品也不能表现得那么好。
使用已发布的设备和化学品并未表明任何竞争利益。

堆肥土（多个供应商）
花盆（直径16厘米）（多个供应商）
铝箔（多个供应商）
10μl蓝宝石低保留过滤器（Greiner Bio One International，目录号：771265）
200μl蓝宝石低保留过滤器（Greiner Bio One International，目录号：737265）
1,000μl蓝宝石低保留过滤器（Greiner Bio One International，目录号：750265）
0.2μm过滤器，Millex GP（默克，目录号：SLGP033RS）
10毫升和50毫升注射器（多个供应商）
50毫升猎鹰管（康宁，目录号：352070）
适用于干燥器（多个供应商）的50毫升Falcon管架。
一次性10毫升和25毫升塑料移液器（多个供应商）
移液器填料（BRAND，目录号：25315）
纸巾（多个供应商）
适用于液氮的防护装备（多个供应商）
用于运输和储存液氮的杜瓦瓶（多个供应商）
Miracloth（默克，目录号：475855-1R）
Sefar Nitex 03-55 / 32（55μm网孔，32％开口面积）（StefanKastenmüllerGmbH）
管（1.5毫升和2.0毫升; SARSTEDT，目录号：72.690.001和72.695.500）
显微镜片（76 x 26 x 1 mm）（多个供应商）
封面（多个供应商）
细胞计数室（Neubauer室）和玻璃盖（Celeromics）
针（0.9 x 40 mm，HSW FINE-JECT）（Henke-Sass，Wolf，目录号：8300025263）
Slide-A-Lyzer TM 带浮标的透析盒（0.5-3 ml，截止值20 kDa）（Thermo Fisher Scientific，目录号：66003）
Parafilm（BRAND，目录号：701605）
用于1.5 ml管（DynaMag-2 Magnet）的磁粉颗粒浓缩器（MPC）（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
15毫升锥形管（康宁，目录号：352196）
橡胶表带或胶带
DynaMag-96侧裙式磁粉颗粒浓缩器（MPC96）（赛默飞世尔科技，目录号：12027）
PCR管，蓝宝石（Greiner Bio One International，目录号：652250）
Snap-cap microTUBE（带AFA纤维和预裂隔膜）（Covaris，目录号：520045）
一次性手术刀（多个供应商）
厚度为0.5至1.0厘米的聚苯乙烯塞（自制）紧密地装入50毫升塑料管中
种子（由实验者提供）
HEPES钠盐（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸钠盐）（Carl Roth，目录号：7020.2）
浓盐酸（Carl Roth，目录号：4625.1）
蔗糖（Carl Roth，目录号：9097.1）
MgCl 2 •6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2670）
KCl（霍尼韦尔，Fluka，目录号：60130）
Triton X-100（Carl Roth，产品目录号：3051.3）
100％甘油（Carl Roth，目录号：3783.1）
苯基甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：93482）
2-巯基乙醇（14.3 M）（Carl Roth，目录号：4227.1）
37％（w / v）甲醛溶液（含10-15％甲醇作为稳定剂）（Sigma-Aldrich，目录号：252549）
甘氨酸（Carl Roth，目录号：3790.1）
液氮
抑肽酶（西格玛奥德里奇，目录号：10820）
Leupeptin（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）
Pepstatin（Sigma-Aldrich，目录号：P5318）
带DAPI的VECTASHIELD封固介质（VECTOR Laboratories，目录号：H-1200）
SDS（十二烷基硫酸钠）（Serva，目录号：20765）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱）（Carl Roth，目录号：5429.3）
NaCl（Carl Roth，目录号：9265.2）
EZlink Iodoacetyl-PEG 2 -Biotin（IPB）（Thermo Fisher Scientific，目录号：21334）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Carl Roth，目录号：6908.1）
Hind III（100 U /μl）（New England BioLabs，目录号：R0104T）
Nhe I（10 U /μl）（赛默飞世尔科技，目录号：ER0971）
MyOne Streptavidin T1珠子（赛默飞世尔科技，目录号：65601）
Na 2 HPO 4 （Carl Roth，目录号：P030.2）
KH 2 PO 4 （Carl Roth，目录号：3904.1）
100 mM dATP（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0142）
100 mM dTTP（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0172）
2'-脱氧鸟苷-5' - （α-硫代） - 三磷酸，钠盐（dGTPαS），1：1 R p 和S p 异构体的混合物（Jena Bioscience ，产品目录号：NU-424S）
生物素-14-dCTP（赛默飞世尔科技，目录号：19518018）
Klenow DNA聚合酶，大片段（10 U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EP0052）
UltraPure BSA（50 mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：AM2616）
T4 DNA连接酶（5U /μl），含10x T4 DNA连接缓冲液和50％PEG 4000（Thermo Fisher Scientific，目录号：EL0011）
RNase A（无DNA酶）（MACHEREY-NAGEL，目录号：740505）
蛋白酶K（Thermo Fisher Scientific，目录号：25530015）
苯酚：CHCl 3 ：异戊醇（25：24：1）（Carl Roth，目录号：A156.2）
8-羟基喹啉（Sigma-Aldrich，目录号：H6878）
异戊醇（Carl Roth，目录号：8930.1）
CHCl 3 （Carl Roth，目录号：3313.2）
糖原（赛默飞世尔科技，目录号：R0561）
100％乙醇（Carl Roth，目录号：9065.4）
Q5热启动高保真DNA聚合酶（2 U /μl）和5x Q5热启动缓冲液（New England BioLabs，目录号：M0493S）
生物素掺入控制（大麦）引物：
引物1（5'-ATCTTCATGCGAGGCAGAGT-3'）
引物2（5'-ACCGTTGAACCATCTTCAGG-3'）
注：引物经HPLC纯化，0.2μmol合成规模，溶于H 2 O至100μM;例如，Sigma-Aldrich进行合成。
dNTP Set（100 mM溶液）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0181）
dNTP Mix（每种25 mM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：R1121）
MinElute凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28606）
Bromophenol Blue（Carl Roth，目录号：A512.2）
10x NEBuffer 1缓冲液（New England BioLabs，目录号：B7001S）
UltraPure琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：16500500）
来自 E. coli 的外切核酸酶III（100 U /μl）（New England BioLabs，目录号：M0206S）
AMPure XP珠子（Beckman Coulter，目录号：A63881）
10x Tango（赛默飞世尔科技，目录号：BY5）
100 mM ATP（赛默飞世尔科技，目录号：R0441）
T4 DNA聚合酶（5 U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EP0062）
T4多核苷酸激酶（10U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EK0031）
Klenow DNA聚合酶，大片段（10U /μl）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EP0052）
Klenow片段，3'→5'exo-（5 U /μl）（New England BioLabs，目录号：M0212L）
Dynabeads MyOne Streptavidin C1（赛默飞世尔科技，目录号：65001）
DNA LoBind试管（1.5 ml）（Eppendorf，目录号：0030108051）
TruSeq DNA单指标集A（Illumina，目录号：20015960）
文库扩增引物：
引物3（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT-3'）
引物4（5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA -3'）
注：引物经HPLC纯化，0.2μmol合成规模，溶于H 2 O至100μM;例如，Sigma-Aldrich进行合成。
SYBR-Gold（赛默飞世尔科技，目录号：S11494）
GeneRuler 50 bp DNA ladder（Thermo Fisher Scientific，目录号：SM0373）
冰醋酸（Carl Roth，目录号：3738.5）
QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28106）
100％异丙醇（Carl Roth，目录号：6752.4）

注意：按照Green和Sambrook（2012）中的描述准备以下解决方案（＃100-＃107）。

1 M Tris-HCl，pH 8.0（100 ml）
1 M Tris-HCl，pH 7.4（100 ml）
1 M Tris-HCl，pH 7.5（100 ml）
0.5 M EDTA，pH 8.0（100 ml）
1 M DTT（20 ml）
苯酚：CHCl 3 ：含0.1％8-羟基喹啉的异戊醇（25：24：1）
CHCl 3 ：异戊醇（24：1）
1M MgCl 2
1 M HEPES，pH 8.0（参见食谱）＆nbsp;
2 M蔗糖（见食谱）
1 M KCl（见食谱）
10％（v / v）Triton X-100（见食谱）
含甲醛的细胞核分离缓冲液（NIBF）（见食谱）
2 M甘氨酸（见食谱）
1 mg / ml抑肽酶（见食谱）
1 mg / ml Leupeptin（见食谱）
1 mg / ml Pepstatin（见食谱）
具有蛋白酶抑制剂（NIBP）的细胞核分离缓冲液（参见食谱）
蔗糖垫（见食谱）
含1.5 M蔗糖（NIBS）的细胞核分离缓冲液（参见食谱）
2％（w / v）SDS（见食谱）
4 M NaCl（参见食谱）
洗涤缓冲液1（见食谱）
25 mM IPB（见食谱）
10x NEBuffer 2（见食谱）
1x NEBuffer 2（见食谱）
Hind III（10 U /μl）（见食谱）
透析缓冲液（TE缓冲液）（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水，吐温20，pH 7.4（PBST）（见食谱）
25 mM中和IPB（参见食谱）
10 mM dATP（见食谱）
10 mM dTTP（见食谱）
洗涤缓冲液2（见食谱）
洗涤缓冲液3（见食谱）
10x连接缓冲液TCC（见食谱）
10毫克/毫升BSA（见食谱）
提取缓冲液（见食谱）
25 mg / ml RNase A（见食谱）
20 mg / ml蛋白酶K（见食谱）
5毫克/毫升糖原（见食谱）
80％乙醇（见食谱）
70％乙醇（见食谱）
3 M醋酸钠，pH 5.2（参见食谱）
EB（见食谱）
EBT（见食谱）
引物1 + 2（每个10μM）（见食谱）
10 mM dNTP混合物（参见食谱）
2.5 mM dNTP混合物（参见食谱）
TLE（见食谱）
吐温洗涤缓冲液（TWB）（见食谱）
2x结合缓冲液（2x BB）（见食谱）
1x结合缓冲液（1x BB）（见食谱）
1x连接缓冲液（见食谱）
引物3 + 4（每种10μM）（见食谱）
6x上样染料（见食谱）
50x TAE（见食谱）

设备

剪刀（多个供应商）
冰桶（多个供应商）
硼硅酸盐玻璃瓶（100毫升）（Laborbedarfshop，目录号：GT00205）
硼硅酸盐玻璃瓶（250 ml）（Laborbedarfshop，目录号：GT00206）
硼硅酸盐玻璃瓶（500毫升）（Laborbedarfshop，目录号：GT00207）
硼硅酸盐玻璃瓶（1,000毫升）（Laborbedarfshop，目录号：GT00208）
Borosilicate Erlenmeyer烧瓶（500 ml）（Laborbedarfshop，目录号：GT00153）
P1,10μlFinnipepipette（Thermo Fisher Scientific，目录号：4641040N）
P10,100μlFinnpipette（Thermo Fisher Scientific，目录号：4641070N）
P20,200μlFinnpipette（Thermo Fisher Scientific，目录号：4641080N）
P100,1000μlFinnpipette（Thermo Fisher Scientific，目录号：4641100N）
砂浆用研杵粗糙表面研磨（直径约10厘米）（多个供应商）
金属勺子（多个供应商）
漏斗适合50毫升管（多个供应商）
筛子或滤茶器（直径约8厘米）（多个供应商）
温室配有自动遮阳和补充灯（钠卤灯）
pH计（多个供应商）
水浴（65°C）（多个供应商）
-20°C冰柜（多个供应商）
-80°C冰柜（多个供应商）
Vortex（多个供应商）
量筒100毫升，1升（多个供应商）
高压灭菌器（多个供应商）
分析实验室天平'Quintix'（0.1 mg至120 g）（Sartorius，目录号：Quintix ® 124-1S）
精密实验室天平'Cubis'（10 mg至2.2 kg）（Sartorius，目录号：MSE2203P-000-DR）
制冰机（多个供应商）
干燥器（多个供应商）
带压力计，冷凝水收集器和管道的真空泵将干燥器连接到真空泵（多个供应商）
通风橱
注意：所有涉及NIBF缓冲区的操作必须在通风橱内进行。在操作和废物处理过程中，请遵守实验室的安全规定。
用于50 ml管的Heraeus Multifuge 4KR离心机（需要3,000 x g ）（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Multifuge 4KR，目录号：75004461）
用于Eppendorf管的Heraeus Fresco 21离心机（需要16,000 xg ）（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus TM Fresco TM 21，目录号：75002426 ）
落射荧光显微镜BX61（奥林巴斯）配备冷却CCD相机（Hamamatsu Orca ER）（参见注1 ）（奥林巴斯，型号：BX61）
培养箱（37°C）（Memmert，型号：600型，目录号：D06062）
摇摆平台（Heidolph Instruments，型号：Titramax 1000，目录号：544-12200-00）
Eppendorf ThermoMixer C（Eppendorf，型号：ThermoMixer ® C，目录号：5382000015），带有1.5 ml管的Smartblock（Eppendorf，目录号：5360000038）
1 L烧杯玻璃（多个供应商）
磁力搅拌棒和磁力搅拌器（多个供应商）
管旋转器（NeoLab，目录号：7-0045）
将培养箱（16°C）（GFL-GesellschaftfürLabortechnik，目录号：3032）置于4°C的冷藏室中
带有分析管的Qubit 2.0（或Qubit 4）荧光计，dsDNA HS Assay和dsDNA BR Assay（Thermo Fisher Scientific，型号：Qubit 4，目录号：Q33227）
热循环仪（多个供应商）
微波炉（多个供应商）
琼脂糖凝胶电泳设备及配件[微波炉，托盘（15 x 15 cm），梳子，电源，电泳缓冲液，琼脂糖，等等）<（多个供应商）
Covaris S220 AFA超声波发生器（Covaris）及相关设备[snap-cap microTUBE（带AFA光纤和预裂隔膜），冷水机，软件，电脑（见注1 ）]
Dark Reader蓝光透照仪（Clare Chemical Research，目录号：DR46B）
Agilent 2100电泳生物分析仪或Agilent 4200 TapeStation系统（Agilent Technologies，型号：Agilent 2100），包括附件和消耗品（参见注1 ）
GenPure Pro UV / UF（赛默飞世尔科技，目录号：50131950）

软件

软件和计算机硬件：
分析Hi-C / TCC序列数据，运行Unix操作系统的计算机服务器（例如，Linux，Solaris，MacOS;参见注1 ）或访问云计算系统（例如，CyVerse， http://www.cyverse.org ）是必须的。常见的UNIX命令行工具（例如）需要可用。为了加速CPU密集型步骤（例如读取对齐），建议访问多核机器（> 16个CPU内核）。根据要分析的样本数量，需要分配硬盘存储空间。
需要安装以下生物信息学软件来执行下面描述的主要数据分析：

Casava， http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/casava.html
Cutadapt， http://cutadapt.readthedocs.io
BWA-MEM， https://github.com/lh3/bwa
SAMtools， http://www.htslib.org/download/
BEDtools， http://bedtools.readthedocs.io

程序

注意：

除非另有说明，否则所有程序均可在室温下进行。
为避免测序库的污染，应使用过滤嘴和手套。
应定期清洁表面，以便用商业产品去除DNA。
用于处理PCR前后样品的实验室空间和仪器必须在物理上分开。
尽管该协议运作良好（> 40次独立实验），但作者对读者进行的实验成功不承担任何责任。

植物生长和收获
1. 将大约100粒大麦种子种植在填充有堆肥土壤的两个盆（直径16cm）中。彻底浇水，在温室中植物生长7天（卤素灯钠灯，光照时间16小时，夜晚：18°C，白天：21°C）。例如，大麦的生长条件在（Zimmermann et al。，2006）中给出。其他植物物种可能需要不同的条件。相应地适应植物栽培。使用具有有利核含量的年轻组织（未扩增细胞）。
2. 种植足够的植物以获得约2.4g的叶子。
3. 用剪刀收割树叶。将叶子包裹在铝箔中并储存在冰上以便运输到实验室，直到准备好进行下一步。
化学交联
1. 将叶子修剪成0.5-1.0cm长的片段，并将约0.8g组织转移到50ml管中。准备3管并存放在冰上。
2. 在通风橱内加入15毫升冷的NIBF到每个管中。将聚苯乙烯塞向下推至液位，以便在真空渗透过程中将叶子浸没在缓冲液中（Hövel et al。，2012）（图2）。
  
  图2.真空渗透过程中的管道安装。将一个紧贴管子的聚苯乙烯塞子向下推到液体表面区域，以确保在渗透过程中浸没叶片段。
3. 将管放入干燥器中并渗入NIBF（150毫巴）。在5,10和15分钟后突然切断真空，以帮助NIBF进入叶片段。继续浸润总共1小时。由于固定剂渗入细胞间隙，渗透后（图3）的片段绿色会变暗（Hövel et al。，2012）（见注2））。
  
  图3.叶片颜色变化图像取自典型叶片段（A）之前和（B）真空渗入NIBF缓冲液（固定剂）。＆nbsp;
4. 切开真空，取出聚苯乙烯塞，加入2.0毫升2M甘氨酸以停止交联（Hövel et al。，2012）。使用一次性25毫升塑料移液管上下移液，彻底混合样品。插入塞子并施加真空（150毫巴）5分钟。
5. 处理塞子并将液体倒入废物容器中。用筛子将叶片保持在50毫升管中（图4）。每管加入40ml纯净水洗净叶子三次。
6. 用纸巾擦干每个管段，并将其存放在冰上直至研磨（图4）。
  
  图4.化学交联后洗涤和干燥叶片段。 A.用纯净水洗涤切片。在倾析期间，使用筛子来保留管中的区段。 B.将来自每个管（约0.8g）的叶片在纸巾上彻底干燥，以便随后在液氮中研磨。
细胞破裂和细胞核分离
1. 在液氮中预冷研钵和研杵（见注3 ）。研磨约0.8克叶子至细粉末。使用金属勺（在液氮中预冷）将粉末转移到预先冷却的50毫升塑料管中（图5A）。用盖子盖住管子，将其刺破几次以确保压力平衡。立即将材料储存在-80°C。相应地准备剩余的2个管。在1周内处理样品以进行细胞核分离。
2. 从-80°冰箱中取出试管后，将含有粉末的3管放在冰上，用25ml塑料移液管将10ml NIBP（Hövel等，2012）加入各管中。用移液管小心混合，完全重悬冷冻块。
3. 为了防止过滤器堵塞，将悬浮液均匀地分配到预先准备的四个漏斗中（如下所述）。
4. 如上所述（Hövel et al。，2012），将悬浮液在4℃下通过Miracloth和Sefar Nitex过滤器置于漏斗中。 Miracloth应该面对植物材料而Sefar Nitex应该面对漏斗表面。仅使用重力流动以避免细胞碎片污染。将滤液收集在50毫升塑料管中（图5B）。
  
  图5.细胞破碎和细胞核过滤。 A.将叶片在液氮中研磨成细粉。使用金属勺将材料转移到50ml管中并立即储存在-80℃。 B.为了分离细胞核，将粉末重悬于10ml NIBP中，并通过Miracloth和Sefar Nitex过滤。将提取物收集在干净的50ml管中，用于随后的离心。
5. 在预冷却的摆出式离心机（3,000 x g ，15分钟，4℃）中旋转四种滤液。使用10ml塑料移液管丢弃上清液，并将每个淡绿色沉淀重悬于1ml冰冷的NIBS中（Hövel et al。，2012）。
6. 将悬浮液转移到四个1.5ml管中并在预冷却的离心机中旋转（1,900 x g ，5分钟，4℃）。弃去上清液，将沉淀重悬于300μl冰冷的NIBS中。
7. 制备四个2.0ml管，每个管含有1.5ml冰冷的蔗糖垫，并且基本上如所述（Abdalla 等人，2009）（图6），在顶部小心地铺上300μl悬浮液。在预冷却的离心机中旋转四个管（16,000 x g ，1小时，4℃）。完全去除上清液，避免用淡绿色顶层污染无色核颗粒。
  
  图6.蔗糖垫。将浅绿色核提取物（e）层叠在蔗糖垫（c）上，并在2.0 ml管中离心，以进一步纯化。
8. 将四个核颗粒中的每一个重悬于100μl冰冷的NIBS中。将两个细胞核悬浮液（200μl）置于1.5ml管中。将两个池放在冰上并进行微观质量检查。
核的微观质量和数量检查（可选）
注意：如果细胞核以常规方式纯化，或者如果没有落射荧光显微镜，可能会跳过显微镜检查。
1. 用含有DAPI的7μlVECTASHIELD封固剂染色7μl细胞核悬浮液进行完整性检查（Hövel et al。，2012）。将染色的样品应用于显微镜载玻片并添加盖玻片。使用落射荧光显微镜（100x物镜，1,000倍放大率，DAPI滤光片，吸收358nm，发射461nm）分析核。完整的细胞核呈圆形或椭圆形，并呈现清晰的轮廓（图7）。
  
  图7.纯化的大麦核。使用落射荧光显微镜（1,000倍放大）检查蔗糖垫离心后的大麦核的完整性，并用DAPI染色。比例尺对应5μm。
2. 用含有DAPI的VECTASHIELD封固剂染色另一等份的细胞核悬浮液用于定量。使用细胞计数室（Neubauer室）和落射荧光显微镜（20x物镜，200倍放大率，DAPI-滤光片，吸收358nm，发射461nm）计数细胞核。确定细胞核的浓度并继续使用大约10个 7 细胞核进行TCC文库构建。
染色质生物素化
1. 在预冷却的离心机（1,900 x g ，5分钟，4℃）中用核悬浮液旋转两个管并弃去上清液。将每个沉淀重悬于900μl冰冷的洗涤缓冲液1中（Kalhor 等人，，2011）。在预冷却的离心机（1,900 x g ，5分钟，4℃）中旋转样品并弃去上清液。
2. 用洗涤缓冲液1重复洗涤步骤。
3. 用洗涤缓冲液1重悬每个沉淀。每个试管应含有125μl体积的样品（整个细胞核制剂的总体积：250μl）。
4. 每管加入48μl2％SDS，并在预热的水浴（65℃，10分钟）中孵育以溶解交联的染色质（Kalhor 等人，，2011）。将样品冷却至室温。
5. 每管加入53μl25mMIPB，并在不透光的容器中搅拌（1小时）以使半胱氨酸残基生物素化（Kalhor 等人，，2011）。
6. 对于SDS的中和，每管加入650μl1xNEBuffer 2并在冰上孵育5分钟（Kalhor 等人，，2011）。
7. 每管加入113μl10％Triton X-100，混合，在冰上孵育（10分钟）和37℃（10分钟）（Kalhor 等人，，2011）。
8. 总反应体积为1,975μl（2管，每管989μl）。
Hind III消化和透析
1. 向每个管中加入50μl10xNEBuffer2,2.5μl1M DTT，215μl水和10μl Hind III /（III U /μl）（Kalhor 等。， 2011）。
2. 每管的总体积为1,267μl。
3. 将两个试管水平孵育在培养箱中（37°C，过夜，在摇动平台上轻轻搅拌）。
4. 将两个消化物汇集并根据制造商的说明将样品（约2.5ml）注入一个预先润湿的Slide-A-Lyzer TM 透析盒（20kDa，3ml）中。缓慢注射以避免DNA的剪切（图8）。吸入盒中剩余的大部分空气，将1L透析缓冲液装入烧杯中，加入磁力搅拌棒，将插入浮标的盒子透析，缓慢搅拌3小时，从而从生物素化反应中除去过量的IPB（ Kalhor et al。，2011）。
  
  图8.透析。 Hind III消化后，将样品（约2.5 ml）缓慢注入预先润湿的Slide-A-Lyzer TM < / sup>透析盒。在透析之前，大部分空气从内部被吸出。将盒子插入浮标浮标并放入透析缓冲液中共4小时。
5. 弃去缓冲液并在1L新鲜透析缓冲液中透析1小时。
6. 如透析盒的制造商所述收集DNA。将样品缓慢地吸入注射器以避免剪切。
7. 将样品均匀地转移到两个2.0毫升的管中。
Tethering
1. 制备MyOne Streptavidin T1珠子（Kalhor et al。，2011）。通过温和涡旋重悬珠子，并在两个1.5ml管中分配200μl（参见注释4 ）。
2. 将试管放入MPC中，等待3分钟并弃去上清液。
3. 从MPC中取出试管，每管加入1ml PBST，轻轻涡旋重悬珠子。将管置于MPC中3分钟并弃去上清液。
4. 用PBST重复洗涤步骤两次。
5. 将每个管中的珠子重悬于1ml PBST（总体积2ml）中。
6. 将透析的样品均匀地分配到五个1.5ml管中，并将PBST加入到每管500μl的最终体积中。标记4管'TCC'和一管'3C'。
7. 向每个管中加入400μl洗过的MyOne链霉抗生物素蛋白T1珠（每管最终体积900μl）并将样品置于管旋转器中30分钟。
8. 在亲和力结合期间，制备25mM中和的IPB。向5个试管中的每一个中加入7μl25mM中和的IPB，并将样品置于管旋转器中15分钟（参见注释5 ）。
标记DNA结束和环化
1. 将五个试管放入MPC中，等待2分钟并弃去上清液。
2. 从MPC中取出试管，每管加入600μlPBST（Kalhor 等，2011）并通过温和涡旋重悬珠子。将管置于MPC中2分钟并弃去上清液。
3. 每管用600μl洗涤缓冲液2重复洗涤（Kalhor 等人，，2011）。
4. 将珠子重悬于每管100μl洗涤缓冲液2中并保持在冰上。
5. 通过按以下顺序添加来制备用于标记4'TCC'样品的DNA末端的主混合物（Kalhor et al。，2011）：
  295μl水
  4.5μl1MMgCl 2
  45μl10xNEBuffer 2
  3.2μl10mM dATP
  3.2μl10mM dTTP
  3.2μl10mMdGTPαS
  68μl0.4mM生物素-14-dCTP
  18μl10％Triton X-100
  11.3μlKlenowDNA聚合酶，大片段（10 U /μl）
  轻轻混合组分（参见注释6 ）
6. 四个'TCC'样品：将100μl主混合物加入到重悬于100μl洗涤缓冲液2中的珠子中。
  '3C'对照：加入100μl1xNEBuffer 2缓冲液（无填充反应且DNA末端没有标记）。
7. 如果不需要用于生物素掺入的3C对照，则使用剩余的3C材料用于另外的第五TCC等分试样。相应地调整主混合物的体积。
8. 将五个样品放入管旋转器中40分钟。
9. 通过向每个管中加入5μl0.5MEDTA，pH8.0来阻止填充反应（Kalhor 等，，2011）并通过倒置充分混合。
10. 将五个试管放入MPC中，等待2分钟并弃去上清液。
11. 从MPC中取出试管，每管加入600μl洗涤缓冲液3（Kalhor 等，2011），轻轻涡旋重悬珠子。＆nbsp;
12. 将管置于MPC中2分钟并弃去上清液。
13. 每管用600μl洗涤缓冲液3重复洗涤。
14. 将珠子重新悬浮在每管500μl洗涤缓冲液3中，并将珠子转移到五个15ml锥形管中（标记四个管'TCC'和一个管'3C'）。
15. 通过添加（Kalhor et al。，2011）来准备主混合物：
  21.1毫升水
  1,350μl10x连接缓冲液TCC
  972μl10％Triton X-100
  540μl1MTris-HCl，pH 7.4
  270μlBSA（10 mg / ml）
16. 将4,480μl主混合物添加到五个锥形管中（总体积4,980μl/管）。
17. 将12μlT4DNA连接酶（5U /μl）加入到四个TCC管中的每一个中，并将3μlT4DNA连接酶（5U /μl）加入'3C'对照中。
18. 通过倒置轻轻混合组分。
19. 在柜中水平孵育（16°C，过夜），搅拌速度足以使珠子保持悬浮状态。
20. 通过向每个管中加入200μl0.5MEDTA，pH8.0来阻止连接（Kalhor 等，，2011）并通过倒置轻轻混合。
21. 通过将五个15ml管水平安装在DynaMag-96 Side Skirted Magnetic Particle Concentrator（MPC96）上来回收珠子。使用胶带或橡皮带将管牢固地固定在磁铁上（图9）。
  
  图9.系留环化产物的回收。将含有连接产物的试管安装在DynaMag-96 Side Skirted Magnetic Particle Concentrator上。回收珠子，弃去上清液，同时将管子放入磁铁中。
22. 孵育5分钟以回收珠子。
23. 使用10ml移液管丢弃上清液。
交联和DNA提取的逆转
1. 向每个15ml管中加入400μl提取缓冲液（Kalhor et al。，2011）并重悬珠。
2. 将珠子转移到五个1.5ml管（四个标记为'TCC'和一个'3C'）。
3. 在37℃温育45分钟后，通过向每个1.5ml管中加入4μlRNaseA（25μg/μl）消化剩余的RNA。
4. 每管加入20μl蛋白酶K（20μg/μl），轻轻混匀，在水浴中孵育（65°C，过夜）（Kalhor et al。，2011）。
5. 每管加入额外的5μl蛋白酶K（20μg/μl），轻轻混合并在水浴（65°C，2小时）中孵育。
6. 将5个试管放入MPC中，等待2分钟，将含有DNA的上清液转移到5个新鲜的1.5ml试管中。
7. 通过向每个管中加入400μl苯酚：CHCl 3 来提取DNA（Kalhor 等人，，2011）。手动摇动1分钟。通过离心分离各相（室温，13,000 x g ，10分钟）。将上层水相转移到新的1.5 ml管中（参见注7 ）。
8. 用400μl苯酚：CHCl 3 重复萃取。
9. 用400μlCHCl 3 重复萃取一次。
10. 将上层水相转移到新的2.0ml管中并测定体积。
11. 对于DNA沉淀，向每个管中加入1/20体积的4M NaCl，1/100体积的糖原（5mg / ml）和2体积的冰冷的100％乙醇（Kalhor 等。，2011）（见注8 ）。
12. 通过倒置将五个管充分混合并在冰上孵育30分钟。
13. 通过离心（4℃，13,000 x g ，30分钟）收集DNA。
14. 小心去除上清液，不要打扰半透明的DNA沉淀。
15. 加入500μl冰冷的80％乙醇并旋转DNA（4℃，13,000 x g ，5分钟）。
16. 丢弃上清液。进行脉冲旋转并去除液体残留物。
17. 将颗粒干燥（5分钟，室温）。
18. 将每个管中的5个DNA颗粒溶解在30μlEB中。将四个TCC样品放入一个1.5 ml管中。通过加入1/10体积的3M乙酸钠，pH 5.2和两倍体积的冰冷的100％乙醇沉淀TCC和3C对照的DNA。
19. 通过倒置充分混合并在冰上孵育30分钟。
20. 通过离心（4℃，13,000 x g ，30分钟）收集DNA。
21. 小心地从两个管中取出上清液。
22. 加入500μl冰冷的80％乙醇。
23. 旋转DNA（4℃，13,000 x g ，15分钟）。
24. 丢弃上清液。进行脉冲旋转并去除液体残留物。
25. 干燥颗粒（5分钟，室温）。
26. 将TCC样品溶解于50μlEB中，将3C对照溶解于10μlEB中。
27. 使用Qubit 2.0（或Qubit 4）荧光计和dsDNA BR Assay确定DNA浓度。浓度应为100-800 ng /μl。
28. 样品可以在-20°C下储存。
29. 测量生物素掺入量（Belton et al。，2012）（参见注释9 ）。
  为3C对照和TCC样品设置两个PCR反应：
  240 ng DNA
  15μl5xQ5热启动缓冲区
  1.5μl10mM dNTPs
  3.75μl10mM引物1 + 2（各10μM）
  0.75μlQ5热启动高保真DNA聚合酶（2U /μl）
  加水至最终体积为75μl
30. 放大1个循环（98°C，40秒，66°C，30秒，72°C，30秒），然后进行35个循环（98°C，10秒，66°C，30秒，72°C，30秒） sec）和最终扩增（98℃10秒，66℃30秒，72℃5分钟）。
31. 根据制造商的说明使用'QIAquick PCR Purification Kit'纯化产品。在23μlEB中洗脱PCR产物。
32. 为'TCC'和'TCC'的3C控制设置一个对照和三个消化（表1）。在37°C孵育（培养箱，过夜）。
  
  表1.用于验证末端标记和结扎的消化装置
33. 加入4μl6x上样染料，在标准2％琼脂糖凝胶上分析产物（Green和Sambrook，2012）。典型结果如图10所示。
  
  图10.用于标记和结扎末端的典型对照。两个密切的基因组大麦 Hind III片段在其连接连接处进行PCR扩增。对扩增的3C连接进行III-III消化，其中连接了Hind III的粘端，产生两个不同大小的片段。相反，TCC连接是由填充和标记的 Hind III末端的平末端连接产生的。结果，形成了新的 Nhe I位点并且原始的 Hind III位点丢失（Belton et al。，2012）。通常，约50-80％的PCR产物被 Nh e 切割。表示产品的尺寸（bp）。凝胶图像取自Mascher 等人（2017）。
从未连接的DNA末端去除生物素和DNA片段化
1. 向5μgDNA（步骤I28）中加入9μl10xNEBuffer 1和水至84μl。
2. 加入6μl外切核酸酶III（100U /μl）。
3. 轻轻混合并孵育（41°C，1小时）（参见注10 ）。
4. 通过添加2μl0.5M EDTA，pH 8.0和2.5μl4M NaCl（Kalhor 等人，2011）来终止反应。
5. 孵育（70°C，20分钟）并用水调节体积至100μl。
6. 使用Covaris S220 AFA超声波仪（Duty Factor：10％，PIP：175 W，每次爆发的周期：200，设定模式：频率扫描，时间：60秒）和Covaris microTUBES将DNA剪切至100-500bp。
7. 通过在标准2％琼脂糖凝胶上运行100ng来控制DNA大小（Green和Sambrook，2012）。如果DNA仍然太大，则添加另一个超声处理循环。
8. 将样品完全转移到1.5 ml管中。准确确定音量。
9. 加入1.8体积的AMPure XP珠（室温），混匀，孵育（5分钟）。
10. 使用MPC回收珠子（2分钟）。
11. 用190μl70％乙醇洗涤珠子30秒，同时将管子置于MPC中。丢弃上清液。
12. 重复洗涤步骤（步骤J11）一次。
13. 完全风干珠子。＆nbsp;
14. 从MPC中取出试管，加入52μlEBT进行洗脱。＆nbsp;
15. 重悬珠子，孵育（1分钟），将管置于MPC中（1分钟）。
16. 将51μl转移到新管中。
17. 样品可以在-20°C下储存。
结束修复和A-tailing
1. 将加热块设置为20°C。
2. 对于最终修复，按以下顺序添加碎片，清理的DNA：
  7μl10xTango
  7μl2.5mM dNTP混合物
  0.7μl100mM ATP
  1.5μlT4DNA聚合酶（5 U /μl）
  2.5μlT4多核苷酸激酶（10U /μl）
  0.3μlKlenowDNA聚合酶，大片段（10 U /μl）
  总体积为70μl
3. 通过上下移液小心混合。
4. 孵育（20°C，30分钟）样品。
5. 准确确定音量。
6. 加入1.8体积的AMPure XP珠（室温），混匀，孵育（5分钟）。
7. 使用MPC回收珠子（2分钟）。
8. 用190μl70％乙醇洗涤珠子30秒，同时将管子置于MPC中。丢弃上清液。
9. 重复洗涤步骤（步骤K8）一次。
10. 完全风干珠。
11. 从MPC中取出试管，加入39μlTLE进行洗脱。
12. 重悬珠子，孵育（1分钟），将管置于MPC中（1分钟）。
13. 将38μl转移到新管中。
14. 通过添加以下内容添加“A”：
  5μl10xNEBuffer 2
  4μl2.5mM dATP
  3μlKlenow片段，3'→5'外 - （5U /μl）
  总体积为50μl（Kalhor et al。，2011）
15. 通过上下移液小心混合并孵育（37°C，30分钟）样品。
16. 在孵育期间，将加热块设定为65℃。
17. 通过加入1μl0.5M EDTA，pH 8.0并在65°C温育20分钟来灭活酶。立即将样品放在冰上。
18. 在灭活期间准备Dynabeads MyOne链霉抗生物素蛋白C1。
生物素下拉
1. 所有后续步骤均在1.5ml DNA LoBind管中进行。
2. Vortex Dynabeads MyOne链霉抗生物素蛋白C1并将10μl转移至1.5ml管中。
3. 加入400μlTWB，通过移液混合并在摇动平台上孵育珠子3分钟。
4. 使用MPC回收珠子（1分钟）并弃去上清液。
5. 从MPC中取出试管，加入400μlTWB并通过移液管混合。
6. 使用MPC回收珠子（1分钟）并弃去上清液。
7. 将珠子重悬于50μl2xBB中并加入50μlDNA用于生物素化DNA片段的亲和纯化（Kalhor 等人，，2011）。
8. 旋转孵育30分钟。
9. 使用MPC回收珠子（1分钟）并丢弃上清液。
10. 将珠子重悬于800μl1xBB中，并将悬浮液转移到新管中。
11. 使用MPC回收珠子（1分钟）并弃去上清液。
12. 用1x BB重复洗涤步骤。
13. 从MPC中取出试管，加入100μl1x连接缓冲液并通过移液管混合。
14. 使用MPC回收珠子（1分钟）并弃去上清液。
15. 从MPC中取出试管，将珠子重悬于38.8μl1x连接缓冲液中。
Illumina配对末端衔接子连接和PCR
1. 通过添加1.5毫升管来设置结扎：
  6μlTruSeqDNA单指标（A组）
  38.8μl珠子与亲和纯化的DNA
  1.1μl10xT4 DNA连接缓冲液
  1.1μlPEG4000（50％）
  1.0μl水
  2.0μlT4DNA连接酶（5 U /μl）。
  注意：要选择“TruSeq DNA索引”，请按照“TruSeq Library Pooling Guide”（Illumina，San Diego，California，U.S.A。）中提供的说明进行操作。
  通过移液充分混合并孵育1小时（22°）。
2. 使用MPC回收珠子（1分钟）并弃去上清液。
3. 将珠子重悬于400μlTWB中并旋转5分钟。
4. 使用MPC回收珠子（1分钟）并弃去上清液。
5. 用400μlTWB重复洗涤两次。
6. 在200μl1xBB中重悬珠子。
7. 使用MPC回收珠子（1分钟）并弃去上清液。
8. 在200μl1xNEBuffer 2中重悬珠子。
9. 使用MPC回收珠子（1分钟）并弃去上清液。
10. 用200μl1xNEBuffer 2重复洗涤。
11. 从MPC中取出管子。
12. 将珠子重悬于20μl1xNEBuffer 2中。
13. 将样品转移到新的1.5ml管中并将珠子结合的TCC DNA储存在冰上。
14. 滴定最佳PCR循环次数（Belton et al。，2012）。
  重悬珠子并加入PCR管：
  1.5μl珠子结合的TCC DNA
  1.3μl10μM引物3 + 4（参见注11 ）
  5.0μl5xQ5热启动缓冲区
  2.0μl2.5mM dNTP混合物
  0.3μlQ5热启动高保真DNA聚合酶（2 U /μl）
  14.9μl水（终体积25μl）。
15. 滴定PCR：在98°C（30秒）初始培养后，进行DNA扩增（20个循环：98°C，10秒，68°C，30秒，72°C，30秒），然后在72°C下最后延伸5分钟。
16. 在9,12,15和20个循环后取4μl等分试样。
17. 使用标准琼脂糖凝胶分析等分试样（图11）。通过与来自梯子的已知DNA量进行比较来估计产品的量。选择PCR循环次数和反应次数（25μl体积）以产生约200-600ng DNA用于测序（参见注释12 ）。为了避免PCR产物的大小分布变化所指示的PCR伪影，建议使用最多15个循环（Belton 等人，，2012）。图11所示的文库在12个循环中产生了足够量的DNA。
  
  图11.滴定PCR。在指定数量的PCR循环后，取出2.4μl反应（初始体积的PCR：25μl），使用标准2％琼脂糖凝胶进行大小分离并染色与溴化乙锭。表示GeneRuler 50bp DNA梯（L）的大小（bp）。 500 bp标记条带对应20 ng DNA。
18. 重悬珠结合的TCC DNA并用计算的反应数设置最终的PCR。使用最佳循环次数进行PCR。
反应清理和尺寸选择
1. 将所有PCR产物汇集在一个1.5ml管中，并将管置于MPC中。
2. 等待1分钟，将含有文库的上清液转移到新的1.5 ml管中进行清理和大小选择（Belton et al。，2012）。
3. 准确确定音量。
4. 加入1.8体积的AMPure XP珠粒（室温），混合，孵育（5分钟）并用MPC回收珠粒（2分钟）。
5. 用190μl70％乙醇洗涤珠子30秒，同时将管子置于MPC中。
6. 丢弃上清液。
7. 重复洗涤步骤（步骤N5-N6）一次。
8. 完全风干珠。
9. 从MPC中取出试管，加入27μlEBT进行洗脱。
10. 重悬珠子并孵育（10分钟）。每2分钟轻拍一次试管，重新悬浮珠子。
11. 将管置于MPC中（1分钟）并将25μl转移至新管中。
12. 使用Qubit 2.0（或Qubit 4）荧光计和dsDNA BR Assay确定DNA浓度。浓度应为10-30 ng /μl。
13. 使用凝胶纯化确保使用适当大小的DNA片段进行测序（Himmelbach et al。，2014）（参见注释13 ）。在500毫升Erlenmeyer烧瓶中称取1克UltraPure琼脂糖。加入50ml 1x TAE缓冲液，用微波炉融化琼脂糖直至完全溶解。将液体冷却至60°C，加入5μlSYBR-Gold（参见注释14 ），轻轻混合，不产生气泡，并使用标准电泳设备浇注凝胶。用铝箔覆盖凝胶，让凝胶固化（光敏染料）。
14. 将250 ng GeneRuler 50 bp DNA ladder转移到试管中，加入4μl6x上样染料，并使用EBT将体积调节至24μl。通过添加5μl6x上样染料制备TCC样品（25μl）。
15. 取出梳子，将凝胶放入装有1x TAE缓冲液的电泳室中。将TCC库加载到两个相邻的插槽中。将标准物应用于一个泳道，以5 V / cm（阳极和阴极之间的距离）进行电泳1小时。在分离过程中保护凝胶免受光照。使用“暗读者”透照仪（参见注释15 ）可视化DNA并拍照。使用干净的手术刀切除300到550 bp之间的区域（图12）。
  
  图12.典型TCC文库的凝胶纯化。在大小分离（标准2％琼脂糖凝胶电泳）和用SYBR Gold染色后，使用可见蓝光发射的“暗读取器透照仪”显示该文库。提取来自约300至550bp的框架区域的DNA用于测序。表示GeneRuler 50 bp DNA ladder（L）的大小（bp）。
16. 将凝胶块放入2.0 ml管中，用天平确定体积（例如，234 mg的块对应234μl）。
17. 使用'MinElute Gel Extraction Kit'纯化DNA，基本上如制造商所述。加入6倍体积的QG缓冲液并在温和搅拌下完全溶解凝胶。
18. 加入一个凝胶体积的异丙醇并通过倒置混合。
19. 将700μl溶解的凝胶应用于MinElute柱。将柱置于收集管中并旋转（16,000 x g ，1分钟）。丢弃流通。
20. 逐步将残余液体添加到柱中（重复步骤N19）。
21. 加入740μlPE洗涤柱，孵育3分钟，旋转柱（16,000 x g ，1分钟）并丢弃流通液（参见注释16 ）。
22. 转动转子中的色谱柱（180°）并旋转（16,000 x g ，1分钟）。
23. 丢弃收集管，将MinElute柱置于干净的1.5 ml管中，并进行洗脱，向树脂中加入50μlEB。
24. 孵育1分钟并旋转柱（16,000 x g ，1分钟）。
25. 将洗脱的TCC文库保存在-20°C。
质量控制，量化和测序
1. 使用Qubit 2.0（或Qubit 4）荧光计（ds DNA HS Assay）测量DNA浓度。浓度应为10-20 ng /μl。
2. 用 Nhe I消化80ng TCC文库以估计来自生物素化连接的连接的部分（Belton 等人，，2012）。通过添加到1.5 ml管中来设置反应：
  80 ng TCC库
  2μl10xTango缓冲液
  1μl Nhe I（10 U /μl）
  水最终体积为20μl
  准备一个未切割的对照（没有 Nhe 我消化）。在37°C孵育过夜。使用2μlGeneRuler50bp DNA ladder作为标准，用2％琼脂糖凝胶分析产物。消化的TCC文库的较小尺寸分布提供了含有真正TCC连接产物的分数的估计值（图13）。
  
  图13.最终TCC文库的质量控制。用 Nhe 消化后，将TCC文库（80 ng）进行大小分离（标准2％琼脂糖凝胶），染色与溴化乙锭相比，未切割的对照组（80 ng）。向较小尺寸分布的转变表明存在 Nhe I位点，这些位点源自真正的TCC结扎事件（Belton et al。，2012; Mascher 等人。，2017）。总的来说，我们发现这种转变是一种安全的质量指标。没有明确转变的文库不应该被测序，因为它们仅产生非常小部分有用的TCC读数。表示GeneRuler 50 bp DNA ladder（L）的大小（bp）。
3. 记录文库的大小配置文件，并使用Agilent高灵敏度DNA试剂盒和Agilent 2100生物分析仪确定TCC文库的平均大小（图14）。
  
  图14.典型TCC文库的大小分布。使用Agilent 2100生物分析仪对TCC文库进行大小分级。平均文库大小（区域1：434bp;包括121bp Illumina P5和P7衔接子）对应于约313bp的平均插入片段大小。 LM：较低的标记峰。 UM：上标记峰。 FU：荧光单位。 bp：碱基对。
4. 使用所描述的Illumina系统（Mascher et al。，2013）对文库进行定量和测序（配对末端，2x100个循环）。

数据分析

主要序列数据分析

运行Illumina CASAVA管道（ http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/casava .html ）以FASTQ格式获取解卷积的读取文件。
使用适配器序列'AAGCTAGCTT'修剪cutadapt（Martin，2011）在连接位点的读数。
使用BWA mem将修剪的读取对与适当的参考基因组对齐（Li，2013）。通过指定参数'-S'和'-P'，应将两个读数映射为单端。参数'-M'应该用于将较短的分割命中标记为次要命名。
按引用位置对BAM文件进行排序以删除重复项。然后通过读取名称再次对BAM文件进行排序，以使一对的两端在BAM文件的相邻行中。其中一个工具SAMtools（Li et al。，2009），Picard（ http：/ /broadinstitute.github.io/picard/ ）或Novosort（ http：//www.novocraft .com / products / novosort / ）可以使用。
使用非唯一对齐删除读取，并使用命令'samtools view -q 10 -F1284'丢弃二次比对，未映射的读取和重复读取。
使用BEDTools为限制片段分配读数（Quinlan和Hall，2010）。您将需要一个BED文件（ https://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat。 html＃format1 ）从 Hind III获得的限制性片段（即，两个 Hind III位点之间的区域）的位置 in silico 您的参考基因组序列的消化。使用命令'bedtools pairtobed -bedpe -f 1 -type both -abam'。生成的BEDPE文件是一个制表符分隔文件，可以使用标准的UNIX文本处理工具（如AWK或Perl）进行处理。一对的两端到限制片段的分配在相邻的线上。
使用UNIX脚本（例如。，在AWK语言中）根据对齐起始位置到相邻 Hind III站点的距离来计算插入大小。丢弃插入物大小超过500 bp的片段，绘制插入物大小分布（图15）并将其与使用Agilent Bioanalyzer获得的片段进行比较。

图15. TCC文库的典型计算机尺寸分布。将序列数据映射到参考基因组并分配给限制性片段。每个测序片段的插入大小由比对起始位置与下一个 Hind III限制位点的距离确定。分布模式用红线表示。

笔记

联系当地销售代表，了解订购，性能和配件。
如果未观察到叶子变黑，则固定剂可能未完全进入，因此表明交联不完全。优化渗透条件，例如通过增加真空或切割较短的植物区段。
必须穿戴适当的防护装备。请咨询贵机构的安全官员，以正确处理液氮。
MyOne链霉抗生物素蛋白T1珠子每毫升提供约250cm 2 表面。通过使用400μl珠子，纯化的染色质以低密度束缚在约100cm 2 的大表面上（Kalhor 等人，2011）。因此有利于DNA末端的分子内连接。
游离链霉抗生物素蛋白残基被生物素饱和，以避免干扰生物素-14-dCTP，其用于在随后的步骤中标记DNA末端（Kalhor 等人，2011）。
在该反应过程中，产生钝性DNA末端，其被生物素化的胞嘧啶残基标记，所述生物素化的胞嘧啶残基位于通过掺入dGTPαS引入的硫代磷酸酯键的3'处（Kalhor 等人，2011）。
在平衡至室温的离心机中旋转样品。低温可能导致形成混浊的水相。在转移过程中避免用间期的蛋白质污染水相。
NaCl用于DNA沉淀，因为该溶液含有SDS（Green和Sambrook，2012）。随后，在乙酸钠存在下沉淀DNA以除去痕量的氯化钠，这对外切核酸酶III具有抑制作用（Hoheisel，1993）。
连接的 Hind III位点（AAGCTT）的连接产生限制酶 Nhe I（GCTAGC）的位点。为了控制填充和平末端连接的有效性，产生来自两个相邻大麦 Hind III /限制片段的PCR片段（534bp）。为了扩增，使用引物1和引物2。
来自 E的外切核酸酶III。大肠杆菌催化从双链DNA的3'-羟基末端逐步除去单核苷酸（New England BioLabs; Rogers and Weiss，1980）。因此，外切核酸酶III允许从未连接的DNA末端去除生物素化的残基。因为位于生物素化胞嘧啶残基5'的硫代磷酸酯键不被外切核酸酶III切割（Putney et al。，1981），真正的连接连接被保留（Kalhor et al。，2011）。
引物3和4与Illumina适配器退火并允许扩增文库。
在常规实验中，11-12个扩增循环就足够了。 8个PCR反应（每个反应25μl体积）应产生足够的DNA用于测序。遵循“黄金法则”以维持文库的复杂性：保持较低的循环次数并增加PCR反应的数量以获得足够的测序文库（Belton et al。，2012）。
Sage Science的BluePippin是标准凝胶纯化的替代品。
不要使用溴化乙锭染色的凝胶。用于激发溴化乙锭的紫外线辐射会破坏DNA。
使用SYBR-Gold染料在琼脂糖凝胶中显示DNA，并从'暗读者'透射仪发射的可见蓝光作为激发源。
将色谱柱始终放置在转子中，因为色谱柱将旋转180°以去除液体痕迹。

食谱

注意：

所有溶液均使用纯净水（GenPure Pro UV / UF）制备，并在室温下储存，除非另有说明。
在整个实验过程中必须采用良好的实验室规范。
咨询您所在机构的安全数据表和实验室/环境安全规则以正确处理试剂和仪器尤为重要。

1 M HEPES，pH 8.0（100 ml）
1. 称取26.0克HEPES钠盐（4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸钠盐）并加入70毫升水
2. 用pH计用浓盐酸搅拌并调节pH至8.0。用水调至100毫升
3. 使用0.2μm过滤器和50 ml注射器灭菌（在室温下在黑暗中储存溶液）
2 M蔗糖（40 ml）
1. 将27.4g蔗糖装入50ml管中
2. 加水至38毫升，将50毫升管置于温水浴中。
3. 以规则的间隔涡旋温热的混合物以完全溶解蔗糖
4. 将体积调节至40 ml并将溶液储存在-20°C
5. 使用前在温水浴中解冻
1 M KCl（100 ml）
1. 将7.5克KCl溶于水中至终体积为100毫升
2. 使用量筒调节体积并通过高压灭菌消毒
3. 在室温下储存
10％（v / v）Triton X-100（45 ml）
1. 将5ml Triton X-100加入45ml水中，加入50ml管中
2. 轻轻混合，避免起泡
3. 储存10％Triton X-100和含有Triton X-100的溶液，在室温下避光保存
含甲醛的细胞核分离缓冲液（NIBF）（Hövel et al。，2012）（200 ml）
将所有组分加入250毫升瓶中，并在使用前储存在冰上：
4毫升1M HEPES，pH 8.0
25毫升2 M蔗糖
200μl1MMgCl 2
1毫升1M KCl
100.8g 100％（v / v）甘油（相当于80ml）
5毫升10％（v / v）Triton X-100
10.7毫升37％（w / v）甲醛
200μl100mM PMSF
0.1％（v / v）2-巯基乙醇
加水至最终体积为200毫升
注意：PMSF抑制丝氨酸蛋白酶，在水中不稳定。由于pH值为8.0时的半衰期为35分钟（James，1978），因此必须在使用前立即加入PMSF。在空气中，甲醛慢慢氧化成甲酸。购买少量并在购买后立即使用。质量差的甲醛会破坏实验。在室温下储存甲醛，因为在寒冷中可能形成沉淀物。在使用前，在通风橱内加入甲醛，PMSF和2-巯基乙醇。彻底搅拌并将溶液冷却在冰上。在组合物之后立即使用NIBF进行真空渗透。 100％甘油（密度1.26g / ml）是粘性的并粘在移液管和量筒上。为方便起见，在玻璃瓶中称重100.8g 100％甘油，相当于80ml。
2 M甘氨酸（40 ml）
1. 称取6.0g甘氨酸加入50ml管中，用水调至40ml
2. 储存于-20°C并在使用前在温水浴中解冻
1 mg / ml抑肽酶（Haring et al。，2007）
1. 将1毫克Apronitin溶于1毫升水中
2. 以-20°C的等分试样储存＆nbsp;
1 mg / ml Leupeptin（Haring et al。，2007）
1. 将1mg Leupeptin溶于1ml水中
2. 以-20°C的等分试样储存＆nbsp;
1 mg / ml Pepstatin（Haring et al。，2007）
1. 将1mg Pepstatin溶于1ml水中
2. 以-20°C的等分试样储存＆nbsp;
具有蛋白酶抑制剂的核分离缓冲液（NIBP）（Hövel et al。，2012）（150 ml）
将所有组分加入250毫升瓶中，并在使用前储存在冰上：
3毫升1M HEPES，pH 8.0
18.8毫升2 M蔗糖
150μl1MMgCl 2
750μl1M KCl
75.6g 100％（v / v）甘油（相当于60ml）
3.8毫升10％（v / v）Triton X-100
150μl100mM PMSF
150μl100％（v / v）2-巯基乙醇
150μl1mg / ml抑肽酶
150μl1mg / ml Leupeptin
150μl1mg / ml Pepstatin
加水至最终体积150毫升
注意：PMSF和2-巯基乙醇在使用前加入通风橱内。彻底搅拌并将溶液冷却在冰上。组成后立即使用NIBP。 100％甘油（密度1.26g / ml）是粘性的并粘在移液管和量筒上。为方便起见，在玻璃瓶中称重75.6克100％甘油，相当于60毫升。
蔗糖垫（20毫升）
将所有组分加入50毫升塑料管中，并在使用前储存在冰上：
400μl1M HEPES，pH 8.0
16.9毫升2 M蔗糖
20μl1MMgCl 2
100μl1M KCl
500μl10％（v / v）Triton X-100
20μl100mM PMSF
20μl100％（v / v）2-巯基乙醇
20μl1mg / ml抑肽酶
20μl1mg / ml Leupeptin
20μl1mg / ml Pepstatin
加水至最终体积为20毫升
注意：PMSF和2-巯基乙醇在使用前加入通风橱内。彻底搅拌并将溶液冷却在冰上。成分后立即使用蔗糖垫。
细胞核分离缓冲液，含1.5 M蔗糖（NIBS）（20 ml）
将所有组分加入50毫升塑料管中，并在使用前储存在冰上：
400μl1M HEPES，pH 8.0
14.9毫升2 M蔗糖
20μl1MMgCl 2
100μl1M KCl
500μl10％（v / v）Triton X-100
20μl100mM PMSF
20μl100％（v / v）2-巯基乙醇
20μl1mg / ml抑肽酶
20μl1mg / ml Leupeptin
20μl1mg / ml Pepstatin
加水至最终体积为20毫升
注意：PMSF和2-巯基乙醇在使用前加入通风橱内。彻底搅拌并将溶液冷却在冰上。合成后立即使用NIBS。
2％（w / v）SDS（100ml）
1. 将2g SDS（十二烷基硫酸钠）溶于70ml水中
2. 轻轻混合，避免起泡，并使用量筒将体积调节至100毫升
3. 溶液可以在室温下储存
4 M NaCl（100 ml）
1. 将23.34g NaCl溶于80ml水中
2. 使用量筒将体积调节至100 ml，通过高压灭菌消毒并在室温下储存
洗涤缓冲液1（50毫升）
将所有组分加入50毫升塑料管中：
2.5ml 1M Mris-HCl，pH 8.0
625μl4M NaCl
100μl0.5MEDTA，pH 8.0
用水调节至最终体积为50 ml（Kalhor et al。，2011）
25 mM IPB（150μl）
将2 mg EZlink Iodoacetyl-PEG 2 -Biotin（IPB）溶于洗涤缓冲液1（最终体积150μl）
注意：使用前请准备好新溶液。 IPB对水分和光敏感。将试剂储存在4-8°C干燥的密闭暗容器中，同时加入干燥的硅酸盐珠粒。在打开之前，将样品瓶平衡至室温，以防止样品瓶中的水分凝结。
10x NEBuffer 2（New England BioLabs）（10 ml）
添加所有组件：
1.25毫升4 M NaCl
1毫升1M Tris-HCl，pH 8.0
1毫升1M MgCl 2
100μl1M DTT
加水至10毫升，并以-20℃的等分试样储存
1x NEBuffer 2
通过用9ml水稀释1ml 10x NEBuffer 2原液来制备
将等分试样储存在-20°C
Hind III（10 U /μl）
将所有组分加入冰上并轻轻混合：
0.5μl Hind III / III（100U /μl）
4.5μl1xNEBuffer 2
使用前新鲜准备
透析缓冲液（TE缓冲液）（2 L）
添加所有组件：
20ml 1M Mris-HCl，pH 8.0
4 ml 0.5 M EDTA，pH 8.0
加水至最终体积为2升
磷酸盐缓冲盐水与吐温20，pH 7.4（PBST）（1升）
添加所有组件：
8.0克NaCl
0.2克KCl
1.44g Na 2 HPO 4
0.24克KH 2 PO 4
加水至800毫升
使用HCl将pH调节至7.4（Green and Sambrook，2012）
加入1ml 10％Tween 20和水至终体积为1L
25 mM中和的IPB（75μl）
1. 将1 mg EZlink Iodoacetyl-PEG 2 -Biotin（IPB）溶于洗涤缓冲液1（最终体积75μl）
2. 取40μl25mMIPB并加入7μl143mM2-巯基乙醇
注意：使用前请准备好新的解决方案。
10 mM dATP
用900μl水稀释100μl100mM dATP并储存在-20°C
10 mM dTTP
用900μl水稀释100μl100mM dTTP并储存在-20°C
洗涤缓冲液2（50ml）（Kalhor et al。，2011）
将所有组分加入50毫升塑料管中：
2.5ml 1M Mris-HCl，pH 8.0
625μl4M NaCl
2毫升10％（v / v）Triton X-100
用水调节至最终体积为50毫升＆nbsp;
洗涤缓冲液3（50ml）（Kalhor et al。，2011）
将所有组分加入50毫升塑料管中：
2.5毫升1M Tris-HCl，pH 7.4
10μl0.5MEDTA，pH 8.0
2毫升10％（v / v）Triton X-100
用水调节至最终体积为50毫升＆nbsp;
10x连接缓冲液TCC（1.5 ml）
将所有组件加入2.0毫升塑料管中：
750μl1MTris-HCl，pH 7.5
150μl1MMgCl 2
150μl100mM ATP
150μl1M DTT
300μl水
注意：＆nbsp;
1. 使用前新鲜配制溶液。
2. 该组合物与来自New England BioLabs的10x反应缓冲液相同。
10毫克/毫升BSA＆nbsp;
1. 将200μlUltrapureBSA（50mg / ml）转移到管中
2. 加入800μl水，混合并储存在-20°C
提取缓冲液（50 ml）（Kalhor et al。，2011）
添加所有组件：
2.5ml 1M Mris-HCl，pH 8.0
100μl0.5MEDTA，pH 8.0
1.25毫升4 M NaCl
1毫升10％（v / v）SDS
用水调节至最终体积为50毫升＆nbsp;
25 mg / ml RNase A（1 ml）
将25 mg RNase A（不含DNA酶）溶于1 ml终体积的水中，并在4°C下储存
20 mg / ml蛋白酶K（150μl）
将3mg蛋白酶K溶于150μl10mMTris-HCl，pH 8.0中在使用前刚刚准备好解决方案
5 mg / ml糖原（100μl）
用75μl水稀释25μl糖原（20mg / ml）并储存在-20℃
80％乙醇（100毫升）
混合80毫升100％乙醇和20毫升水
准备新鲜并存放在一个紧闭的瓶子里
使用前在冰上预先冷却。
70％乙醇（100毫升）
混合70毫升100％乙醇和30毫升水
准备新鲜并存放在一个紧闭的瓶子里
使用前在冰上预先冷却。
3 M乙酸钠，pH 5.2（100 ml）
如Green和Sambrook（2012）所述制备100ml溶液。
EB（50毫升）
添加所有组件：
500μl1MTris-HCl，pH 8.0
49.5毫升水
EBT（50毫升）
添加所有组件：
500μl1MTris-HCl，pH 8.0
250μl10％Tween 20
49.25毫升水
引物1 + 2（各10μM）（100μl）
引物1（100μM，5'-ATCTTCATGCGAGGCAGAGT -3'）
引物2（100μM，5'-ACCGTTGAACCATCTTCAGG -3'）
添加所有组件：
10μl100μM引物1（100μM）
10μl100μM引物2（100μM）
80μl水
在-20°C下储存大麦的引物混合物（生物素掺入对照）（Mascher et al。，2017）
10 mM dNTP混合液（1 ml）
将400μldNTP混合物（各25mM）加入600μl水中并储存在-20°C
2.5 mM dNTP混合液（1 ml）
将100μldNTP混合物（各25mM）加入900μl水中并在-20℃下储存
TLE（50 ml）
Tween Wash Buffer（TWB）（50 ml）（Lieberman-Aiden et al。，2009）
添加所有组件：
250μl1MTris-HCl，pH 8.0
50μl0.5MEDTA，pH 8.0
250μl10％Tween 20
12.5毫升4 M NaCl
用水调节至最终体积为50毫升＆nbsp;
2x结合缓冲液（2x BB）（50 ml）（Lieberman-Aiden et al。，2009）
添加所有组件：
500μl1MTris-HCl，pH 8.0
100μl0.5MEDTA，pH 8.0
25毫升4 M NaCl
用水调节至最终体积为50毫升
1x结合缓冲液（1x BB）（20 ml）（Lieberman-Aiden et al。，2009）
用10毫升水稀释10毫升2倍BB＆nbsp;
1x连接缓冲液（1 ml）
添加所有组件：
90μl10xT4 DNA连接缓冲液
90μl50％PEG 4000
820μl水
储存在-20°C
引物3 + 4（各10μM）（100μl）
引物3（100μM，5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT-3'）
引物4（100μM，5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'）
添加所有组件：
10μl100μM引物3（100μM）
10μl100μM引物4（100μM）
80μl水
将Illumina文库扩增引物混合物储存在-20°C
6x上样染料（1毫升）
添加所有组件：
700μl水
300μl100％（v / v）甘油
一点点溴酚蓝
注意：添加溴酚蓝以获得浅蓝色。超标将在标准琼脂糖凝胶中掩盖DNA（面积在200-300bp之间）。
50x TAE（1升）（Green and Sambrook，2012）
1. 将242克Tris碱溶于去离子水中
2. 加入57.1ml冰醋酸和100ml 0.5M EDTA，pH8.0
3. 将音量调节至1 L并充分混合
4. 将50x TAE原液用水稀释至1x TAE工作溶液并充分混合

致谢

这项工作得到了莱布尼茨植物遗传和作物植物研究所（IPK），Gatersleben的核心资金以及德国联邦教育和研究部（BMBF，FKZ 0315954）向Nils的项目资金（'TRITEX'）的资助。斯坦。感谢Karin Lipfert的平面设计。作者感谢Lala Aliyeva-Schnorr对细胞核的微观分析提供帮助。该方案在很大程度上适用于湿实验室程序（Hövel等人，2012; Lieberman-Aiden等人，2009; Kalhor等人，2011; Belton等人，2012）和先前描述的生物信息学程序（Mascher等人，2017; Beier等人。，2017）。作者声明没有竞争利益或利益冲突。

参考

Abdalla，K.O.，Thomson，J。A.和Rafudeen，M。S.（2009）。从复活植物Xerophyta viscosa进行核分离和核蛋白提取的蛋白质组学研究协议。 Anal Biochem 384（2）：365-367。
Avni，R.，Nave，M.，Barad，O.，Baruch，K.，Twardziok，SO，Gundlach，H.，Hale，I.，Mascher，M.，Spannagl，M.，Wiebe，K.，Jordan ，KW，Golan，G.，Deek，J.，Ben-Zvi，B.，Ben-Zvi，G.，Himmelbach，A.，MacLachlan，RP，Sharpe，AG，Fritz，A.，Ben-David，R 。，Budak，H.，Fahima，T.，Korol，A.，Faris，JD，Hernandez，A.，Mikel，MA，Levy，AA，Steffenson，B.，Maccaferri，M.，Tuberosa，R.，Cattivelli ，L.，Faccioli，P.，Ceriotti，A.，Kashkush，K.，Pourkheirandish，M.，Komatsuda，T.，Eilam，T.，Sela，H.，Sharon，A.，Ohad，N.，Chamovitz ，DA，Mayer，KFX，Stein，N.，Ronen，G.，Peleg，Z.，Pozniak，CJ，Akhunov，ED和Distelfeld，A。（2017）。野生二粒基因组结构和多样性阐明了小麦的进化和驯化。科学< / em> 357（6346）：93-97。
Beier，S.，Himmelbach，A.，Colmsee，C.，Zhang，XQ，Barrero，RA，Zhang，Q.，Li，L.，Bayer，M.，Bolser，D.，Taudien，S.，Groth， M.，Felder，M.，Hastie，A.，Simkova，H.，Stankova，H.，Vrana，J.，Chan，S.，Munoz-Amatriain，M.，Ounit，R.，Wanamaker，S。， Schmutzer，T.，Aliyeva-Schnorr，L.，Grasso，S.，Tanskanen，J.，Sampath，D.，Heavens，D.，Cao，S.，Chapman，B.，Dai，F.，Han，Y 。，Li，H.，Li，X.，Lin，C.，McCooke，JK，Tan，C.，Wang，S.，Yin，S.，Zhou，G.，Poland，JA，Bellgard，MI，Houben ，A.，Dolezel，J.，Ayling，S.，Lonardi，S.，Langridge，P.，Muehlbauer，GJ，Kersey，P.，Clark，MD，Caccamo，M.，Schulman，AH，Platzer，M。，Close，TJ，Hansson，M.，Zhang，G.，Braumann，I.，Li，C.，Waugh，R.，Scholz，U.，Stein，N。和Mascher，M。（2017）。构建基于地图的大麦参考基因组序列 Hordeum vulgare L. Sci Data 4：170044。
Belton，J.M.，McCord，R.P.，Gibcus，J.H.，Naumova，N.，Zhan，Y。和Dekker，J。（2012）。 Hi-C：捕获基因组构象的综合技术。方法 58（3）：268-276。
Burton，J.N.，Adey，A.，Patwardhan，R.P.，Qiu，R.，Kitzman，J.O。和Shendure，J。（2013）。基于染色质相互作用的从头基因组装配的染色体尺度支架。 Nat Biotechnol 31（12）：1119-1125。
Dekker，J.，Rippe，K.，Dekker，M。和Kleckner，N。（2002）。捕获染色体构象。 Science 295（5558）： 1306-1311。
de Wit，E。和de Laat，W。（2012）。三十年的3C技术：洞察核组织。 Genes Dev < / em> 26（1）：11-24。
Duan，Z.，Andronescu，M.，Schutz，K.，McIlwain，S.，Kim，Y。J.，Lee，C.，Shendure，J.，Fields，S.，Blau，C.A。and Noble，W。S.（2010）。酵母基因组的三维模型。 Nature 465（7296）：363-367。
Dudchenko，O.，Batra，S.S.，Omer，A.D.，Nyquist，S.K.，Hoeger，M.，Durand，N.C.，Shamim，M.S.，Machol，I.，Lander，E.S.，Aiden，A.P。和Aiden，E.L。（2017）。使用Hi-C重新组装埃及伊蚊基因组，产生染色体长度的支架。 Science 356（6333）：92-95。
Feng，S.，Cokus，S.J。，Schubert，V.，Zhai，J.，Pellegrini，M。和Jacobsen，S.E。（2014）。野生型和突变体中的全基因组Hi-C分析显示拟南芥中的高分辨率染色质相互作用。 Mol Cell 55（5）：694-707。
Green，M。和Sambrook，J。（2012）。分子克隆。实验室手册。纽约冷泉港实验室。
Grob，S.，Schmid，M。W.和Grossniklaus，U。（2014）。拟南芥中的Hi-C分析识别KNOT，这是一种具有相似性的结构到 Drosophila 的弗拉门戈基因座。 Mol Cell 55（5）：678-693。
Haring，M.，Offermann，S.，Danker，T.，Horst，I.，Peterhansel，C。和Stam，M。（2007）。染色质免疫沉淀：优化，定量分析和数据标准化。植物方法< / em> 3：11。
Himmelbach，A.，Knauft，M。和Stein，N。（2014）。针对Illumina测序优化的植物序列捕获。 Bio-protocol 4（13）：。e1166＆NBSP;
Hoheisel，J。D.（1993）。关于大肠杆菌外切核酸酶III的活性。 Anal Biochem 209（2）：238-246。
Hövel，I.，Louwers，M。和Stam，M。（2012）。植物中的3C技术。方法 58（3）：204-211。
James，G。T.（1978）。在缓冲液中灭活蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟。 Anal Biochem 86（2）：574-579。
Kalhor，R.，Tjong，H.，Jayathilaka，N.，Alber，F。和Chen，L。（2011）。通过系留染色体构象捕获和基于群体的建模揭示的基因组架构。 Nat Biotechnol 30（1）：90-98。
Kaplan，N。和Dekker，J。（2013）。体内 DNA相互作用频率的高通量基因组支架。 Nat Biotechnol 31（12）：1143-1147。
Li，H。（2013）。＆nbsp; 使用BWA-MEM对齐序列读数，克隆序列和装配重叠群。 arXiv preprint arXiV：1303.3997。
Li，H.，Handsaker，B.，Wysoker，A.，Fennell，T.，Ruan，J.，Homer，N.，Marth，G.，Abecasis，G.，Durbin，R。和Genome Project Data Processing， S.（2009）。序列比对/图谱格式和SAMtools。生物信息学 25（16）：2078-2079。
Lieberman-Aiden，E.，van Berkum，NL，Williams，L.，Imakaev，M.，Ragoczy，T.，Telling，A.，Amit，I.，Lajoie，BR，Sabo，PJ，Dorschner，MO，Sandstrom ，R.，Bernstein，B.，Bender，MA，Groudine，M.，Gnirke，A.，Stamatoyannopoulos，J.，Mirny，LA，Lander，ES和Dekker，J。（2009）。远程互动的综合映射揭示了人类基因组的折叠原则。科学 326（5950）：289-293。
Liu，C.，Wang，C.，Wang，G.，Becker，C.，Zaidem，M。和Weigel，D。（2016）。单基因拟南芥中染色质包装的全基因组分析分辨率。 Genome Res 26（8）：1057-1068。
Martin，M。（2011）。 Cutadapt从高通量测序读数中删除适配器序列。 EMBnet.journal v.17，n。 1，p。第10-12页，可能。 ISSN 2226-6089。
Mascher，M.，Richmond，TA，Gerhardt，DJ，Himmelbach，A.，Clissold，L.，Sampath，D.，Ayling，S.，Steuernagel，B.，Pfeifer，M.，D'Ascenzo，M。， Akhunov，ED，Hedley，PE，Gonzales，AM，Morrell，PL，Kilian，B.，Blattner，FR，Scholz，U.，Mayer，KF，Flavell，AJ，Muehlbauer，GJ，Waugh，R.，Jeddeloh，JA和Stein，N。（2013）。大麦全外显子组捕获：大麦属及其他基因组研究的工具。 Plant J 76（3）：494-505。
Mascher，M.，Gundlach，H.，Himmelbach，A.，Beier，S.，Twardziok，SO，Wicker，T.，Radchuk，V.，Dockter，C.，Hedley，PE，Russell，J.，Bayer， M.，Ramsay，L.，Liu，H.，Haberer，G.，Zhang，XQ，Zhang，Q.，Barrero，RA，Li，L.，Taudien，S.，Groth，M.，Felder，M。，Hastie，A.，Simkova，H.，Stankova，H.，Vrana，J.，Chan，S.，Munoz-Amatriain，M.，Ounit，R.，Wanamaker，S.，Bolser，D.，Colmsee， C.，Schmutzer，T.，Aliyeva-Schnorr，L.，Grasso，S.，Tanskanen，J.，Chailyan，A.，Sampath，D.，Heavens，D.，Clissold，L.，Cao，S。， Chapman，B.，Dai，F.，Han，Y.，Li，H.，Li，X.，Lin，C.，McCooke，JK，Tan，C.，Wang，P.，Wang，S.，Yin ，S.，Zhou，G.，Poland，JA，Bellgard，MI，Borisjuk，L.，Houben，A.，Dolezel，J.，Ayling，S.，Lonardi，S.，Kersey，P.，Langridge，P 。，Muehlbauer，GJ，Clark，MD，Caccamo，M.，Schulman，AH，Mayer，KFX，Platzer，M.，Close，TJ，Scholz，U.，Hansson，M.，Zhang，G.，Braumann，I 。，Spannagl，M.，Li，C.，Waugh，R。和Stein，N。（2017）。染色体构象捕获大麦基因组的有序序列。 Nature 544（7651）：427-433。
Metzker，M。L.（2010）。测序技术 - 下一代。 Nat Rev Genet 11（1）：31-46。
Naumova，N.，Imakaev，M.，Fudenberg，G.，Zhan，Y.，Lajoie，B.R.，Mirny，L。A.和Dekker，J。（2013）。组织有丝分裂染色体。 Science 342（6161））：948-953。
Putney，S.D.，Benkovic，S.J。和Schimmel，P.R。（1981）。一端含有α-硫代磷酸酯核苷酸的DNA片段被不对称地阻断外切核酸酶III的消化和可以在体内复制。 Proc Natl Acad Sci USA 78（12）：7350-7354。
Quinlan，A.R。和Hall，I.M。（2010）。 BEDTools：一套灵活的实用工具，用于比较基因组特征。生物信息学 26（6）：841-842。
Rao，S.S.，Huntley，M.H.，Durand，N.C.，Stamenova，E.K.，Bochkov，I.D.，Robinson，J.T。，Sanborn，A.L.，Machol，I.，Omer，A.D.，Lander，E。S.和Aiden，E.L。（2014）。以千碱基分辨率显示的人类基因组三维图谱揭示了染色质循环的原理。 < em> Cell 159（7）：1665-1680。
Rogers，G。和Weiss，B。（1980）。在：Grossman，L。和Moldave，K。（编辑）。 [26] Escherichia coli K-12的核酸外切酶III内切酶。在：酶法中的方法。 65：201-211。纽约：学术出版社。
Sexton，T.，Yaffe，E.，Kenigsberg，E.，Bantignies，F.，Leblanc，B.，Hoichman，M.，Parrinello，H.，Tanay，A。和Cavalli，G。（2012）。果蝇基因组的三维折叠和功能组织原则。细胞 148（3）：458-472。
Wang，C.，Liu，C.，Roqueiro，D.，Grimm，D.，Schwab，R.，Becker，C.，Lanz，C。和Weigel，D。（2015）。拟南芥中 Arabidopsis thaliana 的局部染色质包装的全基因组分析。 Genome Res 25（2）：246-256。
Zhou，X.，Lowdon，R.F.，Li，D.，Lawson，H.A.，Madden，P.A.，Costello，J.F。和Wang，T。（2013）。使用WashU Epigenome浏览器探索远程基因组相互作用。 Nat方法 10（5）：375-376。
Zimmermann，G.，Baumlein，H.，Mock，H.P.，Himmelbach，A。和Schweizer，P。（2006）。多基因家族编码大麦的germin样蛋白。基础宿主抗性的调节和功能。植物生理学 142（1）：181-192。