材料和试剂

移液器吸头（20μl，200μl和1,000μl）*
玻璃注射器2.5 ml，18GA，8.5IN，PT3（Malvern Panalytical，目录号：SYN161714）
一次性硼硅酸盐玻璃管，0.7 ml，6 x 50 mm（O.D。x Height）（DWK Life Sciences，Kimble Chase，目录号：73500-650）
0.22μm真空过滤器*
纯化的烟草（Nicotiana tabacum）14-3-3c蛋白在 E中重组表达。大肠杆菌。蛋白质原液浓度为100μM
注意：如Saponaro等人所述，表达并纯化蛋白质。（2017）。
合成的磷酸肽*（对应于溶解于MilliQ水中的拟南芥 KAT1通道（以下称CPP）的最后5个残基。肽储备浓度为15mM）（肽以CASLO ApS购自冻干粉末，纯度≥98％）
NaCl *，储备浓度5 M（Sigma-Aldrich，目录号：746398）
HEPES *，储备浓度1M，pH 7.4（Sigma-Aldrich，目录号：RDD002）
NaOH *，储备浓度10 M（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
MgCl 2 *，储备浓度2 M（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
β-巯基乙醇*，储备浓度100 mM（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
MilliQ Water *
样品缓冲液（见食谱）

*注意：这些项目可以从任何合适的供应商处购买。

设备

移液器（P10，P20，P200，P1000）*
微量热仪（Malvern Panalytical，型号：MicroCal VP-ITC）
真空泵（与MicroCal VP-ITC一起提供，Malvern Panalytical，型号：ThermoVac，目录号：29013182）
灌装注射器（与MicroCal VP-ITC，Malvern Panalytical一起提供）
塑料管，3毫升（与MicroCal VP-ITC，Malvern Panalytical一起提供）
带转子的台式冷冻离心机FA-45-48-1（Eppendorf，型号：5427 R，目录号：5409000210）
搅拌棒7 mm，用于混合真空泵（ThermoVac）内的溶液（Malvern Panalytical，目录号：BAR150020-005）
紫外光谱仪（Eppendorf，BioSpectrometer ® basic与EppendorfμCuvette® G1.0一起提供，适用于1.5-10μl的体积，目录号：6135000904）
pH计*

*注意：这些商品可以从任何合适的供应商处购买。

软件

Origin软件（版本7，MicroCal，Malvern Instruments Ltd，RRID：SCR_014212）

程序

使用VP-ITC微量热计（Malvern Instruments Ltd）在25℃下进行测量。参比和样品池的体积均为1.4ml。
含有滴定剂（CPP）和滴定的（14-3-3c）分子的溶液必须相同，以避免由于滴定剂稀释到样品池中而引起的热量变化。
下表描述了分别以500μM和50μM浓度制备含有滴定剂（CPP）和滴定（14-3-3c）分子的溶液所需的适当稀释度：表

如表中所示，由于CPP库存在MilliQ水中，在准备14-3-3c稀释时，必须使用相同比例的MilliQ水制备CPP稀释液，以获得相同的滴定剂溶液（CPP））和滴定分子（14-3-3c）。＆nbsp;
在将MilliQ水和样品溶液装入机器之前，将它们与7 mm搅拌棒一起装入3 ml塑料管（见设备）中，然后使用真空泵（ThermoVac）将它们脱气5分钟。该仪器确实设计用于分配3毫升塑料管，并通过将真空与温和搅拌相结合而最喜欢脱气。
将蛋白质和滴定剂在16,000 x g 下离心5分钟，在4°C下离心。
参考/样品池的填充程序（视频1）：
1. 插入2.5毫升玻璃注射器，直到用注射器尖端轻轻触摸电池底部。
2. 缓慢注入溶液，同时从细胞中取出针头。以这种方式，电池从底部到顶部填充，并且操作避免了气泡的形成。
3. 将注射器的尖端定位在细胞端口的可见部分正下方的凸缘上，并抽出液体以从细胞中除去过量的液体。
视频1.参考/样品池的填充程序。视频显示了将溶液正确加载到参考/样品池中所需的步骤（参见步骤5a-5c）。为简单起见，视频仅描述样本单元的填充。
用MilliQ水填充参比池。
用蛋白质填充样品池（在这种情况下为14-3-3c，50μM）。
注意：为了获得可靠的测量，必须精确填充参考和样品池。与细胞的最大容量相比，可以通过加载更大体积的溶液（推荐2ml）来进行该操作。通常，纯化蛋白质的低产率限制了该操作。尽管如此，使用至少1.6毫升，以确保适当加载样品。正确加载溶液是一个关键步骤，以避免形成气泡，严重影响测量。
注射器的体积为300μl。因此，为了适当加载滴定剂，准备至少500μl滴定剂样品。
按照以下步骤将滴定剂（在本例中为CPP，500μM）装入注射器（视频2）：
1. 将注射器的塑料管连接到注射器的注射口。
2. 将滴定剂样品放入玻璃填充管中，并将其插入机器的移液器支架中。
3. 缓慢抽出灌装注射器的柱塞，抽出含有滴定剂的溶液。
4. 一旦滴定剂溶液开始离开填充口，就清除底部的“密闭填充口”。
5. 执行重新填充步骤以清除注射器中的任何气泡。
视频2.注射器的灌装步骤。视频显示了将滴定剂正确装入注射器所需的步骤（参见步骤9a-9e）。
使用10μl的注射体积滴定CPP。连续注射之间的间隔为150秒。共进行了29次注射。
注意：第一次注射的体积是2μl，是固定注射量的1/5。这需要平衡注射器的尖端和样品池的周围溶液之间的界面。在数据分析期间必须丢弃由第一次喷射引起的热量变化。由于首次注射2μl，将使用加入注射器的300μl中总共292μl滴定剂，并在实验后将8μl留在注射器中。
值得注意的是，滴定剂和滴定分子的浓度，以及注射体积和连续注射之间的间隔时间适合于该方案中使用的分子。必须针对每个样品优化这些参数。
注意：在设定参数的初始阶段，应保持滴定剂和滴定分子之间浓度的10倍差异。这通常确保对于在nM至μM范围内具有结合亲和力的那些相互作用的结合反应的完全饱和。如果有证据表明所研究系统的结合亲和力在100μM至mM范围内，则应增加滴定剂与滴定分子之间浓度的倍数差异。
＆NBSP; 此外，间距应设定为180秒，这通常是足够长的时间，以确保在滴定剂注入后完全恢复热基线。如果您的测量需要不同的时间返回基线，请将间隔时间调整到您的系统。只要基线完全恢复并且滴定剂/滴定分子的浓度和注射体积相同，就可以组合从不同间隔时间进行的测量推断的数据。

数据分析

用Origin软件（版本7，MicroCal，RRID：SCR_014212）分析量热数据，并描述了单点结合模型的方程式（Wiseman 等人，，1989）。值得注意的是，该程序通常遵循MicroCal VP-ITC系统（Malvern Instruments Ltd）的“仪器手册”。

图2. CPP-14-3-3c相互作用的ITC测量。 A. CPP（500μM）与14-3-3c（50μM）结合的原始ITC数据。通过从ITC主控制列表中选择“积分所有峰”选项，计算连续注入10μlCPP到含有14-3-3c的样品池中的负热变化面积（μcal/ sec），以便测量每次CPP注射滴定释放的热量。峰的区域用红色着色。 B.量化的热变化（红色圆圈），相对于CPP：14-3-3c的摩尔比标准化的每摩尔注射的CPP标准化，通过选择“一组”选项拟合到单点结合模型。网站“在软件中实现的模型拟合列表中。这将生成拟合曲线（蓝线），插入热变化（红色圆圈），以及化学计量的相关值（N，黑色标记），缔合平衡常数（K A ，橙色标记），焓（ΔH，绿色标记）和结合反应的熵（ΔSblack标记）。所有这些值都显示在蓝色虚线框中。 C.由上面板（对应于面板A）和下面板（对应于面板B）组成的最终ITC图。下图还显示了由软件执行的计算的示意图，以获得：ΔH作为初始H值和平台H值之间的差值（带双箭头的绿线）; K A ，它是截取等温曲线指数相位的橙色线的斜率值（蓝线）; N，即等温曲线中心的摩尔比（CPP：14-3-3c）（用黑色虚线表示）。

图2通过使用获得CPP-14-3-3c相互作用的结合曲线所需的单结合模型，总结了ITC原始数据的处理及其后续分析。图A显示在将10μlCPP（500μM）连续注入含有14-3-3c（50μM）的样品池期间的负热变化（μcal/ sec）。根据背景技术部分和图1中所示的基本ITC原理，这种行为表明CPP-14-3-3c相互作用释放热量，因此结合反应是放热的。

该软件自动集成峰值。该操作在图2的图A中用红色着色的图形表示。数据分析的一个关键方面是对集成细节的正确评估：基线和集成范围。该软件自动设置集成细节并集成峰值。然而，存在信噪比低并且集成细节的自动计算不够准确的情况。在这些情况下，需要根据MicroCal VP-ITC的“仪器手册”说明手动调整基线和积分范围。

此外，软件自动将积分峰标准化为CPP浓度，并将它们与CPP（滴定剂）：14-3-3c（滴定分子）的摩尔比进行绘图（图2中的红色圆圈，图B）。在图B中，插入红色圆圈的实线蓝线表示与单点结合模型的非线性最小二乘拟合（Wiseman et al。，1989）。该软件计算结合反应的化学计量（N），缔合平衡常数（K A ），焓（ΔH）和熵（ΔS）。在图2的面板B中，这些值显示在蓝色虚线框内。 N，K A 和ΔH直接来自等温曲线，因此它们产生拟合误差。另一方面，间接计算的ΔS不会产生拟合误差。

吉布斯自由能（ΔG）不是由软件计算的，但可以由操作员计算（见下文）。
图2C由面板A和B组成，对应于最常用于出版的最终ITC图形。
为了更好地理解软件执行的操作，面板C包括软件如何计算的图形表示，从等温曲线开始，ΔH，N和K A 。
由氢键和范德华相互作用引起的结合焓（ΔH）计算为起始H值和平台H值之间的差值（参见图2C中的绿线）。如上所述，ΔH值相对于每摩尔滴定剂标准化。
化学计量（N）对应于等温曲线中心的摩尔比（参见图2C中的黑色虚线）。
注意：准确评估生物分子的浓度非常重要，因为化学计量参数对其浓度非常敏感。
缔合平衡常数（K A ）对应于截取等温曲线的指数相的线的斜率（参见图2C中的蓝线）。可以通过使用以下等式手动计算解离平衡常数（K D ），这是更常用于描述生物分子亲和力的平衡常数：

结合熵（ΔS），由于生物分子的去溶剂化和最终由复合物形成诱导的构象变化，使用以下等式间接计算：

吉布斯自由能（ΔG）使用以下等式间接计算：

笔记

1.如“数据分析”部分中所述，生物分子的浓度对于计算结合关系的化学计量非常重要。因此，第一次评估所研究的生物分子的浓度时，建议使用至少两种不同的方法以确保其浓度的准确性。例如，在这种特殊情况下，我第一次量化了14-3-3c原料的浓度，我使用了两种不同的方法：基于Bradford的方法，以及使用摩尔消光系数值的280 nm吸收法14-3-3c的（ε），我在理论上使用ProtParam工具计算出来（ https://web.expasy .ORG /的protParam / ）。
ITC测量应至少重复三次，以获得足够的统计数据。＆nbsp;
应通过滴定剂与缓冲液滴定来进行对照测量，以评估滴定剂注射本身引起的热量变化。如果滴定剂注入导致显着的热量变化，则应使用此测量值来减去由滴定剂 - 滴定分子结合关系将滴定剂稀释到缓冲液中产生的热量变化。

食谱

样品缓冲液
100 mM NaCl
30 mM HEPES（pH 7.4）
10mM MgCl 2
2mMβ-巯基乙醇
注意：
1. 不要使用Tris-HCl和DTT，因为它们会通过产生强烈的热量变化严重影响测量。如果有必要保持还原状态，建议使用β-巯基乙醇。
2. 上述缓冲液与该特定方案中使用的蛋白质和分子一起使用。必须针对其他样本优化缓冲区。

致谢

该方案改编自Saponaro 等人（2017），并且通常遵循MicroCal VP-ITC系统（Malvern Instruments Ltd）的“仪器手册”。这项工作得到了Lincean Academy（意大利科学院），Giuseppe Levi基金会的支持。
利益冲突或利益冲突：无。

参考

Saponaro，A.，Porro，A.，Chaves-Sanjuan，A.，Nardini，M.，Rauh，O.，Thiel，G。和Moroni，A。（2017）。 Fusicoccin通过稳定与14-3-3蛋白的相互作用来激活KAT1通道。 em>植物细胞 29（10）：2570-2580。
Wiseman，T.，Williston，S.，Brandts，J.F。和Lin，L。N.（1989）。使用新的滴定热量计快速测量结合常数和结合热。 Anal Biochem 179（1）：131-137。