材料和试剂

50毫升无菌Falcon管（SARSTEDT，目录号：62.657.254）
一次性移液吸头10-200μl（Ultratip，Greiner Bio One International，目录号：739290）
一次性移液吸头100-1,000μl（Ultratip，Greiner Bio One International，目录号：686290）
8,000 MW截止膜（Spectra / Por膜，Spectrum Laboratories）
1.5毫升无菌Eppendorf管（Eppendorf，目录号：0030125150）
0.5ml无菌Eppendorf PCR管（Eppendorf，目录号：0030124537）
0.2 ml无菌Eppendorf PCR试管（Eppendorf，目录号：0030124332）
MicroBioSpin色谱柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：7326221）
电子。大肠杆菌总脂质提取物（Avanti Polar Lipids，目录号：100500P）
乙醇96％（VWR，目录号：VWRC20823.362）
实验室洗涤瓶中的dH 2 O.
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S3014-5KG）
Tris base（罗氏诊断，目录号：10708976001）
SMA 3：1溶液，25％w / v（Polyscope Polymers，XIRAN ®，目录号：SL25010 S25）
MES干粉（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）（Sigma-Aldrich，目录号：E7750）
N-羟基磺基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS）（Sigma-Aldrich，目录号：56485）
胱胺二盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：30050）
1,4-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，Fluka BioChemika，目录号：43817）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418-250ML）
Atto488马来酰亚胺（Atto-TEC，目录号：AD 488-41）
Atto532马来酰亚胺（Atto-TEC，目录号：AD 532-41）
100 mM MES缓冲液pH 7.0（参见食谱）
25 mM MES缓冲液pH 7.0（参见食谱）
75 mM MES缓冲液pH 5.8，EtOH 25％（参见食谱）
Tris-HCl 20 mM pH 8.0（参见食谱）
Tris-HCl 20 mM pH 8.0，NaCl 200 mM（参见食谱）

设备

P10，P20，P200和P1000 Pipetman移液器（Gilson，产品目录号：F167300）
离心1.5和2.0毫升Eppendorf管（Eppendorf，型号：5424 R）
磁力搅拌器热板
10毫米搅拌棒
pH计（Fisher Scientific）
Thermomixer舒适性（Eppendorf，型号：ThermoMixer ®舒适，目录号：5355 000.011）
精密电池石英比色皿（Hellma，目录号：105.202-QS）
紫外分光光度计（Shimadzu）

程序

SMA修改
我们开发了该方案以获得硫醇修饰的SMA（SMA-SH）。目的是在马来酸的羧基和胱胺的胺基之间形成酰胺键。然后在标记前使用二硫苏糖醇（DTT）还原二硫醇桥（图1）。我们靶向一小部分羧基（此处为1％）以保持亲水/疏水平衡，从而保持溶解性和增溶能力。羧基的反应增加了疏水性，因此一定比例的马来酸降低了溶解度和膜溶解效率。我们使用商品化的XIRAN ®树脂，其中苯乙烯与马来酸的比例为3：1，但该程序与其他共聚物组合物相容。

图1. SMA修改和标记协议的工作流程。每个步骤都在文中详细介绍。 SMA-SH和标记的SMA-SH可以在4°C下储存。从修饰到标记，该方案需要4天时间，最终用共价键合的马来酰亚胺染料替代巯基的羧基。

化学反应的每个步骤都可以在图2中进行。反应可以在玻璃烧杯中的塑料管中进行，但为了密封反应并防止EtOH蒸发，我们选择50ml Falcon管。

图2. EDC介导反应的一般方案。仅描述了预期的产品。反应在pH6.5的溶液中进行
1. EDC活化和Sulfo-NHS稳定化
  在第一步中，EDC活化羧基，形成不稳定的反应中间体。可以通过添加Sulfo-NHS来稳定该中间体。 EDC催化的交联通常在低pH（~4.5）下进行以提高效率，但由于SMA 3：1溶解度的pH依赖性，我们在pH 6.5下进行反应（Scheidelaar 等。，2016）。如果pH值降至6.0以下，溶液倾向于从透明液体变为略微乳状的凝胶，因此注意溶液的清晰度非常重要。
  SMA化学改性的主要实验问题是避免pH过低或其中一种试剂的局部浓度过高。这就是为什么我们将粉末溶解在少量MES缓冲液中，然后再添加到含SMA的溶液中。
  为了改变3：1苯乙烯马来酸共聚物中1％的羧基，我们计算出1克共聚物对应于4.47毫克羧酸酯基团，因此1％改性相当于45微摩尔/克聚合物。
  1. 在温和的搅拌器搅拌下，将4ml SMA 25％（w / v）储备溶液稀释在6ml 100mM MES缓冲液（pH7.0）中。＆nbsp;
  2. 在500μlMES75mM pH 5.8和25％乙醇中以20％摩尔过量（54μmol/ g聚合物）溶解45μm的EDC和Sulfo-NHS。将它们逐滴加入溶液中并在室温下在搅拌下孵育20分钟。溶液应保持液体和透明。
2. 添加胱氨酸
  为了提高反应效率，必须避免形成白色颗粒状聚集体，特别是在添加胱胺时。为了减少沉淀物的形成并提高反应效率，证明有用的是略微增加溶剂的疏水性，为此我们添加了25％的乙醇，如果出现乳白色聚集体。
  1. 将溶解在500μl25mMMES pH 7.0的25％EtOH中的2倍过量（108μmol/ g聚合物）的胱胺二盐酸盐滴加到SMA溶液中。由于这一步很重要，因此应该非常谨慎地完成。每滴之间等待1分钟以观察溶液行为，如果溶液变得不透明或者出现聚集物，则滴加EtOH 96％，直至澄清（图3）。
    
    图3.什么是“好”反应。当加入化合物时，半透明液体可形成滴状白色聚集体。如果这些在几分钟后没有消失，则滴加96％的EtOH并等待~15分钟。反应混合物可以恢复到半透明状态，或者有时保留聚集体形成乳状态。
  2. 当溶液稳定时，即，在加入胱胺后2小时，它不会变成乳状或凝胶状，在室温下孵育12小时，同时用50ml Falcon盖覆盖以避免EtOH蒸发。
3. 透析
  该溶液现在含有SMA，SMA-SH以及化学试剂和MES缓冲液中的其他低分子量产物。透析允许缓冲液交换适合于下一反应和去除低分子量产物的缓冲液。
  1. 在室温下将溶液透析至100倍过量体积的Tris-HCl 20mM pH8.0，用8,000MW截止膜轻轻搅拌。
  2. 1小时后更换透析缓冲液并再透析3小时。
  3. 收集SMA-SH溶液并将其储存在4°C直至使用。
SMA-SH标签
在通过马来酰亚胺共价标记之前必须减少SMA-SH。马来酰亚胺和SMA-SH之间共价键形成的关键是还原的硫醇基团的可用性和可接近性。因此，重要的是将气氛和溶液之间的接触减少到最小。氧会氧化巯基，从而阻止与马来酰亚胺的反应。＆nbsp;
1. 根据所需标记的SMA-SH的量，将5倍过量的DTT（0.27μmol/ g聚合物）加入适量的SMA-SH中，并在室温下孵育15分钟。
  注意：使用小管进行此实验以限制大气与溶液之间的接触，例如，分别为1.5,0.5或0.2 ml Eppendorf塑料管，超过500μl，超过100μl或低于100μl的最终体积。
2. 在8,000MW截止膜中对10倍体积的Tris-HCl pH 8.0，NaCl 200mM在室温下透析2小时。＆nbsp;
3. 在还原和透析后立即将1.3倍过量的马来酰亚胺（1mg预先溶解在200μlDMSO中）加入到SMA-SH溶液中，并在22℃下在Tris-HCl 20mM pH 8.0 NaCl 200mM中孵育24小时。避免光线和空气。＆nbsp;
4. 使用MicroBioSpin Chromatography Columns（Promega）去除任何未反应的荧光团。简而言之，通过在1,000 xg 下离心1分钟来洗涤柱缓冲液，加入500μlTris-HCl 8.0，NaCl 200mM，并在1,000 xg下再次离心2分钟。最后，添加标记反应并在1,000 x g 下离心4分钟。
标记的SMALP形成
由于羧酸酯基团取代和马来酰亚胺基团接枝，标记的SMA-SH比未改性的SMA更缓慢地溶解膜。然而，在通常用于纳米圆盘形成的比例（即，3g SMA对1g脂质）中，在SMA，SMA-SH或标记的SMA-SH之间没有观察到纳米圆盘性质的差异（图4）。

图4.由SMA或SMA-SH形成的纳米圆盘的直径和形状。 A.由SMA（橙色圆圈），SMA-SH（蓝色钻石）或标记的SMA-SH（粉红色三角形）形成的纳米圆盘直径）使用DLS（动态光散射）进行分析。在使用3g SMA / 1g膜比时，纳米圆盘具有相当的直径。由SMA（B）或SMA-SH（C）形成的纳米圆盘也显示出通过TEM观察到的类似尺寸。比例尺= 50 nm。
1. 干燥500微克 E.在氮气流下，将大肠杆菌总脂质提取物（Avanti Polar Lipids）在真空下蒸发15分钟，以消除任何痕量的溶剂。＆nbsp;
2. 通过强烈涡旋将干燥的脂质膜分散在Tris-HCl 20mM pH 8.0，NaCl 200mM中。
3. 然后向脂质溶液中加入适量的荧光SMA以获得所需的SMA与脂质的比例，并在室温下混合孵育1小时。通常将3g标记的SMA与1g分散的脂质（w / w）混合。
4. 通过超速离心1小时，在140,000 x g 下去除任何未溶解的物质。＆nbsp;
5. 收集含有标记纳米圆盘的上清液，玩得开心！

数据分析

基于洗涤的标记SMA-SH反应的吸收光谱的分解来计算SMA标记的程度（图5）。 SMA的量由260nm处的吸收和来自吸收最大吸收的荧光团（Atto488分别为500和Atto532分别为550nm）计算。标记的SMA-SH溶液的吸收光谱在UV光谱仪（Shimadzu）上的石英比色皿中记录700至200nm（中速增加1nm）。在测量吸光度之前可能需要稀释标记的SMA-SH溶液以避免强度饱和。光谱以.csv格式提取。然后使用以下公式计算标记程度：

SMA的消光系数为6989M -1 •cm -1 的ε SMA （Grethen et al。， 2017年; Oluwole 等。，2017）。 Atto染料的消光羧酸盐系数为ε Atto 9×10 4 M -1 •cm -1 和 Atto-TEC文献。在我们的例子中，对于Atto488，染料吸光度最大为500 nm。

图5.用Atto-488标记的SMA-SH的吸收光谱。使用对应于SMA-SH的260nm吸收和Atto488的500nm吸收光谱来计算公式中提到的标记程度＆NBSP;

食谱

100mM MES缓冲液pH 7.0（100ml）
通过搅拌将1.952g MES干粉溶解在90ml dH 2 O中用HCl滴定至pH7.0 用dH 2 O调节体积至100 ml
25 mM MES缓冲液pH 7.0（100 ml）
通过搅拌将0.488g MES游离酸溶于90ml dH 2 O中。用HCl滴定至pH7.0 用dH 2 O调节体积至100 ml
75mM MES缓冲液pH 5.8，EtOH 25％（100ml）
通过搅拌将1.463克MES干粉溶解在90毫升dH 2 O中加入26毫升EtOH 96％
用HCl滴定至pH7.0 用dH 2 O调节体积至100 ml
Tris-HCl 20mM pH 8.0（1L）
通过搅拌溶解2.423g Tris碱与700ml dH 2 O
用HCl滴定至pH8.0 使用dH 2 O将音量调节至1 L
Tris-HCl 20mM pH 8.0，NaCl 200mM（1L）
通过搅拌溶解2.423g Tris碱和11.688g NaCl与700ml dH 2 O 用HCl滴定至pH8.0 用dH 2 O将音量调节到1 L

致谢

作者感谢V. Prima，JP Duneau和Y. Rhamani提供了宝贵的技术支持和非常有益的讨论。这项工作得到了CNRS和Espoir contre la Mucoviscidose的支持。
该协议已在Schmidt和Sturgis，2018中使用。作者声明没有利益冲突。

参考

Carraway，K。L.和Koshland，D。E.，Jr。（1972）。 [56]碳水化合物对蛋白质的修饰。方法Enzymol 25：616-623。
Charvolin，D.，Perez，J.B.，Rouviere，F.，Giusti，F.，Bazzacco，P.，Abdine，A.，Rappaport，F.，Martinez，K.L。和Popot，J.L。（2009）。使用amphipols作为通用分子适配器将膜蛋白固定在固体支持物上。 Proc Natl Acad Sci USA 106（2）：405-410。
Dorr，J.M.，Koorengevel，M.C.，Schafer，M.，Prokofyev，A.V.，Scheidelaar，S.，van der Cruijsen，E.A.，Dafforn，T.R.，Baldus，M。和Killian，J.A。（2014）。四聚体K + 通道：原生纳米圆盘的强大功能。 Proc Natl Acad Sci USA 111（52）：18607-18612。
Duquesne，K.，Prima，V。和Sturgis，J。N.（2016）。膜蛋白溶解和蛋白质洗涤剂复合物的组成。方法Mol Biol < / em> 1432：243-260。
Giusti，F.，Kessler，P.，Hansen，R.W。，Della Pia，E.A.，Le Bon，C.，Mourier，G.，Popot，J.L.，Martinez，K.L。和Zoonens，M。（2015）。含有多组氨酸的amphipol的合成及其用于固定膜蛋白的用途。 Biomacromolecules 16（12）：3751-3761。
Grethen，A.，Oluwole，A。O.，Danielczak，B.，Vargas，C。和Keller，S。（2017）。由苯乙烯/马来酸（2：1）共聚物介导的纳米圆盘形成的热力学。 Sci Rep 7（1）：11517。
Grisshammer，R。和Tate，C。G.（1995）。用于结构研究的完整膜蛋白的过表达。 Q Rev Biophys 28（3）：315-422。
Jamshad，M.，Grimard，V.，Idini，I.，Knowles，TJ，Dowle，MR，Schofield，N.，Sridhar，P.，Lin，Y.，Finka，R.，Wheatley，M.，Thomas， ORT，Palmer，RE，Overduin，M.，Govaerts，C.，Ruysschaert，JM，Edler，KJ和Dafforn，TR（2015）。含有脂质双层纳米粒子的结构分析，用于无去污剂的膜提取蛋白质。纳米研究 8（3）：774-789。
Knowles，T.J.，Finka，R.，Smith，C.，Lin，Y.P.，Dafforn，T。和Overduin，M。（2009）。膜蛋白在含苯乙烯马来酸共聚物结合的含脂纳米粒子中完整溶解。 J Am Chem Soc 131（22）：7484-7485。
Le Bon，C.，Della Pia，E.A.，Giusti，F.，Lloret，N.，Zoonens，M.，Martinez，K.L。和Popot，J.L。（2014）。寡核苷酸衍生的amphipol的合成及其用于捕获和固定膜蛋白的用途。 Nucleic Acids Res 42（10）：e83。
Lindhoud，S.，Carvalho，V.，Pronk，J。W.和Aubin-Tam，M。E.（2016）。 SMA-SH：改性苯乙烯 - 马来酸共聚物，用于脂质纳米圆盘的功能化。 Biomacromolecules 17（4）：1516-1522。＆nbsp;
Oluwole，A.O.，Danielczak，B.，Meister，A.，Babalola，J.O.，Vargas，C。和Keller，S。（2017）。使用二异丁烯/马来酸共聚物将膜蛋白溶解成功能性脂质双层纳米圆盘。 Angew Chem Int Ed Engl 56（7）：1919-1924。
Popot，J。L.（2010）。 Amphipols，nanodiscs和氟化表面活性剂：研究水溶液中膜蛋白的三种非常规方法。 Annu Rev Biochem 79：737-775。
Prabudiansyah，I.，Kusters，I.，Caforio，A。和Driessen，A.J。（2015）。 Sec易位子环状脂质壳的表征。 Biochim Biophys Acta 1848（10 Pt A）：2050-2056。
Scheidelaar，S.，Koorengevel，M。C.，van Walree，C.A.，Dominguez，J.J。，Dorr，J.M。和Killian，J.A。（2016）。聚合物组成和pH对苯乙烯 - 马来酸共聚物膜溶解的影响。 Biophys J 111（9）：1974-1986。
Schmidt，V。和Sturgis，J。N.（2018）。修饰苯乙烯 - 马来酸共聚物用于研究脂质纳米圆盘。 Biochim Biophys Acta 1860（3）：777-783。