材料和试剂

小鼠胚胎成纤维细胞（或其他宿主细胞）
MP12（或其他病毒）
Dulbecco's改良的Eagle培养基（DMEM）（Life Technologies，Gibco ，目录号：11965-084）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F2442）
青霉素 - 链霉素（Life Technologies，Gibco ，目录号：15140-122）
L-谷氨酰胺（Life Technologies，Gibco ，目录号：35050-061）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Life Technologies，Gibco，目录号：14190-136）
0.05％胰蛋白酶（Life Technologies，Gibco ，目录号：25300-054）
乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：459844）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P5368）
甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：252549）
TritonX-100（Sigma-Aldrich，目录号：78787）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2158）
一级抗体：小鼠抗RVFV ID8（从ATCC Schmaljohn USAMRIID私下获得）
二抗：AlexaFluor山羊抗小鼠488（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：A11029）
Hoechst 33342（Sigma-Aldrich，目录号：B2261）
板密封膜（Denville Scientific，目录号：B1212-4）
完成DMEM（参见配方）
固定剂（见配方）
PBST（参见配方）
块（参见配方）

设备

黑色，透明底96孔板（Corning Incorporated，目录号：3712）
T75烧瓶（Corning Incorporated，目录号：430725）
II型层流罩（ESCO Corporation）
具有5％CO 2的Thermo Forma系列II 37℃孵育器（Thermo Fisher Scientific，Forma，目录号：3110）
血细胞计数器（Hausser Scientific Brightline）
多通道移液管（Fisherbrand，目录号：FJ19506）
Matrix Well Mate（可选）（Thermo Fisher Scientific）
板振荡器（Barnstead International，目录号：4625）
离心机（Eppendorf，目录号：5810R）
多通道集气器吸气器（Drummond，目录号：3-000-096）
无菌盆（Thermo Fisher Scientific，目录号：13681500）
Quatracide（Thermo Fisher Scientific，目录号：50200423）
自动倒置显微镜（Molecular Devices Image Express Micro）

软件

图像分析软件（MetaXpress：Molecular Devices版本2.0.0.13）

程序

在96孔板中生长细胞
1. 使用活细胞的所有步骤应当在II型层流罩中使用无菌技术进行。将MEF在37℃下用5％CO 2保持在完全DMEM中的T75烧瓶中，并且每2-3天用0.05％胰蛋白酶1:10通入新鲜烧瓶中。
2. 从MEF的汇合瓶中取出用过的培养基，并在5ml DPBS中洗涤。取出DPBS，用2毫升0.05％胰蛋白酶处理几分钟，直到细胞脱落。加入8ml新鲜的完全DMEM和移液器上下数次以破碎细胞团并产生单细胞悬浮液
3. 使用血细胞计数器细胞，并将其在完全DMEM中稀释至200,000个细胞/ml，在无菌盆中。使用多通道移液器添加100微升的细胞到96孔板的每个孔（20,000个细胞/孔）。
  可选：为了降低变异性和进行高通量测定，可以使用Well Mate平板细胞。参见Filone et al。（2010），了解详细说明。
4. 在标准生长条件下，在37℃/5％CO 2孵育箱中孵育过夜。
用RVFV感染
1. 使用无菌多通道吸气器和真空歧管从96孔板的孔中删除培养基，并更换为100μl新鲜培养基。我们在Quatracide中对吸气器消毒15分钟，然后在70％乙醇中洗涤注意：
  1. 如果恒定的最终体积不是关键的，则可以省略该步骤。特别是，我们在进行药物治疗时添加它，以使添加的药物浓度准确和一致。
  2. 对于药物治疗，将DPBS中的药物稀释至最终所需浓度的20倍，并每孔加入5μl。在感染前在37℃孵育1小时。
2. 在完全DMEM中稀释RVFV原液至所需MOI（通常为MOI 1-5），并向每个孔中加入10μl。
  注意：
  1. 病毒感染应在适当的生物防范（RVFV MP12为BSL2）下进行。
  2. 病毒应该以小等分试样储存在-80℃，以避免反复冻融，
3. 轻轻摇动平板5分钟，以确保均匀分布和感染
4. 将板在室温下以1,200RPM离心1小时注意：根据病毒和宿主细胞类型，此步骤可能会被省略，但可以大大提高某些病毒（如RVFV）获得的感染水平。
5. 在孵化器中孵育10小时。
固定和染色
1. 步骤在室温下进行，除非另有说明，否则摇动
2. 用吸气器除去上清液。
3. 在100μl（4％甲醛/PBS）中加入固定剂10分钟注意：一旦固定板，就不再需要无菌的设备和试剂。
4. 使用多通道吸气器和真空歧管去除修复，并添加100微升PBST（PBS + 0.1％Triton X100）渗透细胞膜。细胞将保持粘附到96孔板的底部。孵育10分钟，取出并重复PBST洗涤一次，共2次PBST洗涤
5. 取出液体，孵育细胞在4℃块（PBST + 2％BSA）10分钟。删除块。
6. 稀释初级抗体（小鼠抗RVFV ID8 1：1,000）在4℃块，并添加25微升到每个孔使用多通道移液器。用板密封膜密封，并在4℃下孵育过夜
7. 取出一抗，并在PBST中洗涤孔3次，每次10分钟
8. 稀释荧光标记的第二抗体（山羊抗小鼠488; 1：1,000）和Hoechst 33342核染色（1：1,000）块，并添加25微升到每个孔。
9. 在室温下孵育平板1小时，避光保护
10. 将板在PBST中洗涤3次，每次10分钟。在每个孔中留下100μlPBST，用板密封膜密封，并在4℃下储存直到成像
成像和分析
1. 我们使用自动倒置显微镜在10倍放大图像为4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和异硫氰酸荧光素（FITC）渠道的每个孔中的多个网站。 DAPI通道用于成像Hoechst 33342核染色，FITC通道用于成像二抗AlexaFluor山羊抗小鼠488，其标记病毒抗原。
2. 使用图像分析软件（例如MetaXpress）来测量每个孔的细胞总数（DAPI）和感染细胞（FITC）。这些值然后用于计算感染百分比（FITC/DAPI * 100）。

食谱

完成DMEM
DMEM
10％FBS
100μg/ml青霉素/链霉素 2mM L-谷氨酰胺 10 mM Hepes
固定剂
将甲醛溶液稀释至4％的PBS溶液
PBST
将Triton X-100稀释至0.1％的PBS溶液
阻止
2％BSA溶于PBST中储存在4°C

致谢

该协议改编自Filone等人（2010）; Moser等人（2010）; Nakamoto （2012）; 和Moser等人（2012）。

参考文献

Filone，C.M.，Hanna，S.L.，Caino，M.C.，Bambina，S.，Doms，R.W.and Cherry，S。（2010）。对人类细胞和昆虫宿主的裂谷热病毒感染是由蛋白激酶Cε。 PLoS One 5（11）：e15483。
Moser，T.S.，Jones，R.G.，Thompson，C.B.，Coyne，C.B.and Cherry，S。（2010）。一个kinome RNAi屏幕通过控制将AMPK标识为促进痘病毒进入肌动蛋白动力学。 PLoS Pathog 6（6）：e1000954。
Moser，T.S.，Sabin，L.R。和Cherry，S。（2010）。 RNAi筛选参与牛痘病毒感染的宿主因子果蝇细胞。 J Vis Exp （42）。
Moser，T.S.，Schieffer，D。和Cherry，S。（2012）。 AMP激活的激酶通过抑制脂肪酸来限制裂谷热病毒感染 PLoS Pathog 8（4）：e1002661。
Nakamoto，M.，Moy，R. H.，Xu，J.，Bambina，S.，Yasunaga，A.，Shelly，S.S.，Gold，B。和Cherry，S。 Toll-7的病毒识别在果蝇中激活抗病毒自噬。 Immunity 36（4）：658-667。
Rose，P.P.，Hanna，S.L.，Spiridigliozzi，A.，Wannissorn，N.，Beiting，D.P.，Ross，S.R.，Hardy，R.W.，Bambina，S.A.，Heise，M.T.and Cherry，天然抗性相关巨噬细胞蛋白是辛德毕斯病毒的细胞受体。昆虫和哺乳动物宿主。 Cell Host Microbe 10（2）：97-104。
Sabin，L.R.，Zhou，R.，Gruber，J.J.，Lukinova，N.，Bambina，S.，Berman，A.，Lau，C.K.，Thompson，C.B.and Cherry，S。 Ars2调节miRNA和siRNA依赖性沉默并抑制果蝇中的RNA病毒感染。 138（2）：340-351
Shelly，S.，Lukinova，N.，Bambina，S.，Berman，A。和Cherry，S。（2009）。自噬是果蝇免疫反应水泡性口炎的重要组成部分病毒。免疫力 30（4）：588-598