材料和试剂

1.5毫升微量离心管（MIDSCI，目录号：MID15C）
1,000μl移液器吸头（MIDSCI，目录号：AVR4）
200μl移液器吸头（MIDSCI，目录号：AVR1）
1000μl宽口径移液器吸头（Genesee Scientific，目录号：22-426）
200μl宽口径移液器吸头（Genesee Scientific，目录号：22-423）
显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-19）
Semimicro刮刀（Fisher Scientific，目录号：14-374）
一次性接种环，10μl（VWR，目录号：12000-810）
100 x 15 mm培养皿（Tritech Research，目录号：T3301）
0.22μm无菌注射器过滤器（Spectrum Chemical Manufacturing，目录号：882-66597）
一次性塑料注射器（Thermo Fisher Scientific，目录号：S7510-10）
Serratia marcescens 菌株SM2170，BSL2（Sue Katz，罗杰斯州立大学）＆nbsp;
大肠杆菌菌株OP50，BSL1（Caenorhabditis遗传中心）
GFP标记的 C.线虫（株JK2735）（Caenorhabditis遗传中心）
线虫生长培养基Lite粉末（美国生物，目录号：N1005）
LB颗粒（Fisher Scientific，目录号：BP9723-500）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：P288-100）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S671-500）
磷酸氢二钠无水（Na 2 HPO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：S374-500）
无水硫酸镁（MgSO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：M65-500）
氨苄青霉素钠盐（Dot Scientific，目录号：DSA40040-25）
家用漂白剂＆nbsp;
LB肉汤（见食谱）
NGM Lite板材（见食谱）
大肠杆菌（OP50） - 种子NGM Lite板（见食谱）
M9缓冲液（见食谱）
1 M MgSO 4 溶液（见食谱）
氨苄西林200 mg / ml（见食谱）

设备

手工计数器（United Scientific Supplies，目录号：HTCP01）
2升烧瓶（Corning，PYREX ®，目录号：5320-2L）＆nbsp;
P1000μl移液器（Eppendorf，型号：Research ® plus，目录号：3121000120）
P100μl移液器（Eppendorf，型号：Research ® plus，目录号：3121000074）
-80°C冰箱（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Innova ® U725）
用于1.5 ml微量离心管的台式离心机（Eppendorf，型号：5424）
20°C受控环境室（Percival Scientific，型号：I36NLC8）
28°C摇床培养箱（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：Innova ® 42R，目录号：M1335-0010）
立体显微镜（奥林巴斯，型号：SZX16）
LED透射光照明底座（奥林巴斯，型号：SZX2-ILLT）
用于立体显微镜的GFP过滤器（Olympus，型号：SZX2-FGFP）
立体显微镜物镜7x-115x（Olympus，型号：SDFPLAPO1XPF）
荧光照明灯（Excelitas Technologies，型号：X-Cite ® 120Q）
X-Cite ®液体光导（Bulbtronics，Excelitas Technologies，型号：805-00038）
高压灭菌器（STERIS，型号：SG-120）
化学通风橱（Kewaunee Scientific，型号：H05）

软件

JMP Pro 12.0.1（SAS Institute Inc.，Cary，NC）

程序

注意：

该协议专门描述了在粘质沙雷氏菌（SM2170）存在下实验进化后测量群体竞争适应度的变化。然而，它可以适于在存在任何可以在所述条件下生长和传播的寄生虫的情况下测量任何两种或更多种感兴趣的线虫群体之间的相对适合度。没有特定的实验线虫菌株或实验进化方案是使用该方案简单地作为测量适合度的手段所必需的。但是，需要明确标记的GFP菌株。
在实验进化之前，0代祖先线虫应在-80°C冷冻。类似地，在实验进化结束时，有必要冻结实验进化的群体以用于这些和任何其他后续测定。冻结协议可以在Stiernagle（2006）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/）中找到。
此过程持续约2周。有关程序计划的示例，请参阅表1.

表1.程序每日时间表示例

解冻实验和测试人群
1. 从-80°C冰箱中取出以下每种菌株的一个冷冻管：＆nbsp;
  1. 第0代祖先＆nbsp;
  2. 实验进化的感兴趣的人群＆nbsp;
  3. GFP标记的测试菌株（JK2735）＆nbsp;
  注意：如果测量相对竞争适合度，解冻2个或更多感兴趣的线虫群体和GFP标记的测试菌株。
2. 让管在室温下解冻。
3. 解冻后，轻轻颠倒管几次以混合溶液。
4. 将管的全部内容物倒入标记的100mm E中。大肠杆菌 OP50种子NGM Lite平板。
5. 让板吸收所有液体成分。如果液体含量未被完全吸收，请在化学通风橱中将盖板短暂干燥并盖上盖子。
6. 将这些板在20℃孵育24小时。
7. 检查平板，看到至少50个线虫在解冻后存活。如果是这样，将平板在20°C温育，使群体从解冻中恢复并扩张（约1周）。如果没有，为感兴趣的人群解冻另一个冷冻管并重复解冻过程。
准备同步
1. 一旦生成0祖先，实验进化，并且GFP标记的测试者群体已经扩展到每个平板上观察到数百个个体的点，您可以继续。
2. 对于每个群体，使用火焰灭菌的金属刮刀从含有线虫的平板上切下约2.5cm 2 的NGM Lite。
3. 对于每个人群，从原始板上取下这片NGM Lite并将其面朝下放在新的100 mm OP50种子NGM Lite板上。
4. 将这些新板在20°C孵育48小时。
5. 48小时后，在显微镜下观察步骤B4的板以检查蛋。如果在平板表面上观察到至少约1,000个卵，则进行程序C.如果不是，则将平板在20℃下孵育并在第二天检查。如果平板耗尽OP50，线虫将不再产卵。在这种情况下，请重复步骤B2-B5。
同步
注意：同步协议改编自Stiernagle（2006）。同步的目的是杀死所有线虫，只留下沉积在平板上的卵子才能存活。这将使蛋阶段的人口同步年龄。＆nbsp;
1. 一次加工一个平板，在平板上加入2毫升M9缓冲液。
  注意：一些M9缓冲液将被吸收到板中。因此，向板中加入2ml M9缓冲液将导致从板中收集~1ml。
2. 将板平移到一侧，用M9缓冲液清洗板的整个表面。
  注意：如果平板上的细菌草坪看起来厚而粘，请用移液器吸头轻轻刮去平板表面。这有助于放松鸡蛋。
3. 倾斜平板以允许所有M9缓冲区在一个区域中汇集。＆nbsp;
4. 用移液管移除M9缓冲液并将其移入1.5 ml微量离心管中。
5. 重复步骤C1-C4，使每个群体都在自己的微量离心管中。
6. 将离心管在845 x g 下离心30秒以形成沉淀。
7. 使用管之间的新移液管尖端从每个管中除去上清液。
8. 在含有颗粒的每个管中加入800μlM9缓冲液。
  注意：步骤C9-C17应在3分钟或更短时间内完成，以防止漂白剂损坏鸡蛋。
9. 在每个含有颗粒和800μlM9缓冲液的离心管中加入200μl家用漂白剂。
  注意：这将在每个管中产生20％的家用漂白剂溶液。
10. 关闭并倒置管几次以混合漂白剂和M9缓冲液，并松开颗粒。
11. 将管在845 x g 下离心30秒。
12. 使用管之间的新移液管尖端从每个管中除去上清液。
13. 用1ml M9缓冲液洗涤每个沉淀。关闭并倒置管几次以松开颗粒。
14. 将管在845 x g 下离心30秒。
15. 使用管之间的新移液管尖端从每个管中去除上清液。
16. 重复步骤C13-C15。
  注意：您将洗涤沉淀两次。
17. 将每个管子的整个颗粒吸移到自己的新的100 mm OP50种子NGM Lite板上，确保更换管子之间的尖端。
18. 将平板在20°C孵育48小时，或直到线虫处于幼虫期L4。
Serratia 选择板（SSPs）的制备
1. 在同步的同一天（参见表1-第10天），将OP50和SM2170（或相关的寄生虫）各自接种到5ml LB中。在28℃下孵育过夜，以160rpm振荡。
2. 第二天，在装有25毫升NGM Lite的100毫米培养皿的底部，在培养皿中间划出约2.5厘米的条纹，将培养皿分成3个部分（见图1）。
  注意：
  1. 使用非潮湿的板材很重要。为了干燥板的表面，可以将它们放置在化学通风橱中，盖子关闭约20分钟。务必同时清除印版盖板上多余的冷凝水。
  2. 制作足够的SSP以正确复制祖先和每个实验进化的群体。我们建议每个至少重复3次。
  图1. 100毫米培养皿底部的视图，中间有~2.5厘米的条带
3. 移取35μlOP50（~2.9×10 9 CFU / ml）到NGM Lite的远端三分之一上，并使用无菌接种环将OP50均匀地扩散到切片内。首先镀OP50非常重要，以防止SM2170污染并在板的这一部分扩散。将细菌移液到SSP上时，只能排放到移液器的第一个位置，以防止溅到板上。
4. 在相反的三分之一的NGM Lite上，移取35μl的SM2170（~7.8×10 8 CFU / ml）并使用无菌接种环在该部分内均匀地扩散细菌。再次，确保只排放到第一个移液器停止。中间三分之一将留空。
5. 保持平板水平以防止细菌扩散到其他部分，在28°C下将SSP孵育过夜。
计算线虫浓度
1. 在漂白剂同步线虫种群后48小时，向含有同步线虫的平板中加入2ml M9缓冲液。
  注意：＆nbsp;
  1. 线虫应该处于L4幼虫阶段。
  2. 一些M9缓冲液将吸收到板中。因此，向板中加入2ml M9缓冲液将导致从板中收集约1ml。
2. 将M9缓冲液从一侧到另一侧倾斜，以清洗板的整个表面。
3. 保持平板倾斜以汇集M9缓冲液，并在群体之间使用新的大口径移液管尖端，将每个线虫群收集到其自己的1.5毫升微量离心管中。
  注意：在转移活线虫时使用大口径吸头以避免损坏秀丽隐杆线虫并提高测量精度。
4. 将含有线虫的管在94 x g 离心30秒以形成沉淀。
5. 用M9缓冲液洗涤沉淀2次（如步骤C12-C16中所述，除了在离心时使用94 x g ）。
6. 将种群洗涤两次后，将线虫重悬于1ml M9缓冲液中。
7. 将微型离心管反转几次以混合。
8. 一次操作一个群体，并使用大口径移液器吸头，取3-20μl样品，放在显微镜载玻片上（见图2）。
  
  图2.在M9缓冲液中含有3-20μl线虫样品的显微镜载玻片
9. 在显微镜下，使用手动计数器计数每个20μl样品中的线虫数。
  注意：为了准确计数，每个样本中应该有大约30-50个线虫。如果线虫的数量超出该范围，适当稀释或浓缩含有线虫的离心管，并将3个新的20μl样品取出到显微镜载玻片上。这可能需要不止一次才能获得正确的近似范围。
10. 计算3个样本的平均值并除以20，得到每1μl线虫的平均浓度。
11. 使用以下等式计算给出100个线虫所需的体积：
  体积= 100 / x
  其中x是每1μl线虫的平均浓度，在步骤E10中计算。
12. 对第0代祖先重复步骤E7-E11，每个实验进化 C.线虫种群和GFP标记的测试菌株。
  注意：感兴趣的线虫群体将在同一平板上与GFP标记的测试菌株竞争。因此，如果计算的焦点菌株体积和GFP测试菌株总量超过~150μl，则需要浓缩线虫，重复步骤E7-E11。
竞争祖先或实验“焦点”人群与SSP上的测试人员菌株
1. 在将线虫引入SSP之前，在板的中间部分添加氨苄青霉素条带。（20μl200mg / ml氨苄西林）（见图3）
  注意：SM2170非常运动。氨苄青霉素可防止SM2170扩散到SSP的OP50部分。
  
  图3.沙雷氏菌选择板（SSP）设计包括氨苄青霉素
2. 在SSP的寄生虫侧，在步骤E11中计算的体积中添加目标聚焦宿主群和GFP标记的测试菌株。根据需要复制每个实验群体和祖先群体，以为每个群体生成多个伪复制CFA。
3. 移取到3个OP50播种的NGM Lite板上，计算步骤E11中计算的体积，如下所示：
  1. 第0代祖先
  2. 实验进化的菌株
  3. GFP标记的测试菌株
  注意：这些平板将在程序G中计算，以确定添加到SSP测定板的实际平均宿主数。
4. 使SSP保持水平并在室温下干燥约20分钟。
5. 将SSP在20°C孵育48-72小时，或足够时间让竞争群体繁殖，并使后代处于幼虫期L1 / L2。
评分SSP分析
注意：必须将GFP过滤器与立体显微镜和荧光照明灯一起使用，以便可视化咽部GFP标记。＆nbsp;
1. 在SSP的OP50中，在SSP的一个横截面中，从200个总后代的样本中计算焦点和GFP测试子代的数量（见图4）。
  注意：在计数期间必须在高亮度和低亮度之间交替。高背景光将使计数器可视化所有后代，而低背景光将允许计数器区分焦点和GFP标记的菌株。
  
  图4.比较局灶性和GFP测试菌株。 A.非GFP和GFP表达 C的示例。线虫个体将出现在高背光条件下。比例尺= 0.1毫米。 B.表达GFP的GFP的实例。在低背光条件下的线虫。局灶性菌株不表达GFP。比例尺= 0.1 mm。
2. 从步骤F3计算每个种群的3个OP50接种平板中每一个上的成体宿主数。取3个计数的平均值，并使用此数字计算焦点与测试菌株亲本的初始比率。
计算实验进化后的平均相对适应度和适应度变化百分比
1. 可以将焦点群体或菌株（实验群体或祖先群体）对测试菌株的相对竞争适合度计算为在测定过程中非GFP与GFP表达个体的比率的相对变化。具体而言，这被确定为：
  
  其中WX是局部应变的相对适合度，x是局部应变后代的比例，y是最初在SSP上铺板的局部应变亲本的比例。有关竞争健身的样本数据集，请参见补充数据在 C上进行的分析。线虫宿主群体在SM2170（进化）存在下进化，宿主群体在热灭活的SM2170（对照）存在下进化30代。大于1的相对适合度值表明相对于测试菌株的焦点应变的适应性更大。然而，相对适合度值小于1表示相对于焦点应变的更大的测试者应变适应度。最后，通过平均每个伪复制品的相对适合度值来计算每个焦点菌株的平均相对适合度。
2. 在实验演变之后，实验人群的平均竞争适应度的百分比变化可以计算为：
  
  其中，W̅E是所有伪复制品中实验群体的平均相对适应度，W̅A是所有伪复制品中祖先种群的相对适应度（补充资料）。阳性百分比变化值表明实验人群在实验进化期间的适应度增加。相反，负百分比变化值表明实验人群的适应度下降。重要的是，对于每个独立进化的重复种群，应分别计算平均适合度的百分比变化。我们发现，在进化治疗下进化的人群中平均适应度的变化百分比比在对照治疗下进化的人数更大（补充数据和图5）。

数据分析

这些分析先前在Penley 等人（2017）中描述，不同之处在于分析实验与测试菌株（GFP）后代的平均比例，而不是相对竞争适合度测量。所有分析均在JMP Pro 12.0.1中进行。
平均相对竞争适应度的值和平均竞争适应度的百分比变化可以使用方差分析（ANOVA）和随后的最小二乘平均线性对比度测试来比较特定菌株，群体或治疗，以测试不同固定效应内的因子（0.05）阿尔法值）。但是，数据必须符合方差的正态性和同质性的ANOVA假设。可以将Shapiro-Wilk测试（正态性）和Levene测试（方差同质性）应用于数据集，以测试使用ANOVA分析数据的适当性。如果数据不符合ANOVA的假设，尽管转换，则可以通过非参数Kruskal Wallis检验分析数据。我们测试了治疗（进化与对照）对平均竞争适应度变化百分比值的主要影响（表2），并发现了显着的治疗效果（表2和图5）。

表2. ANOVA表。测试治疗（进化与对照）对竞争健康的平均变化百分比的主要影响。

图5.使用补充数据的示例数据的示例数据结果

值得注意的是，实验进化处理中的独立复制群体可作为分析的真实重复。因此，所有伪重复的平均值用于统计分析，作为代表每个独立进化的重复群体的值。因此，重复群体充当随机效应并且与ANOVA模型中的相关治疗嵌套。

笔记

由测试菌株携带的GFP标记是显性的。当仅测定 C时，该CFA最有效。来自焦点菌株/群体和测试菌株的线虫雌雄同体。 ℃。线虫雄性可以与雌雄同体远交。焦点人群雄性可能与测试者菌株雌雄同体异常交配。如果发生这种情况，来自这些杂交杂交的后代将表达GFP，导致低估了局灶性菌株相对适合度。

食谱

LB肉汤（200毫升）
1. 将5g LB颗粒加入200ml dH 2 O中并搅拌直至溶解
2. 将5ml等分到每个试管中，并为每个试管加盖
3. 高压灭菌20分钟，在4°C下储存长达3个月
NGM Lite板（1升）
1. 将29g NGM Lite粉末加入到含有1L dH 2 O的2L烧瓶中
2. 用铝箔和高压灭菌器覆盖20分钟
3. 一旦冷却到足以触摸，将~25毫升NGM Lite倒入100毫米培养皿中
4. 在4°C下储存长达3个月
Escherichia coli （OP50） - 种子NGM Lite牌照＆nbsp;
1. 接种 E.在LB中的大肠杆菌 OP50，在28℃下孵育过夜，以160RPM振荡
2. 第二天，每个NGM Lite平板加入200μlOP50培养物
3. 将培养物扩散到培养皿的整个表面上
4. 在28°C孵育过夜
5. 在4°C下储存长达1个月
M9缓冲液（1升）（改编自Stiernagle，2006年）
1. 加入3g KH 2 PO 4 ，6g Na 2 HPO 4 ，5g NaCl和1ml将1M MgSO 4 溶液加入量筒中
2. 将dH 2 O加入1L并搅拌直至溶解
3. 分装成瓶子并保持盖子松动
4. 高压灭菌20分钟
5. 在室温下储存长达6个月
1M MgSO 4 溶液（100ml）
1. 将12.037g MgSO 4 加入100ml dH 2 O中
2. 搅拌至溶解并在室温下储存长达1年
氨苄青霉素200毫克/毫升（10毫升）
1. 将2 g氨苄青霉素钠盐加入15 ml管中，加入dH 2 O至10 ml
2. 搅拌至溶解并过滤灭菌（0.22μm）
3. 在-20°C下以1 ml等分试样储存长达1年

致谢

该协议改编自先前的工作（Morran et al。，2009; Morran et al。，2011; Morran et al。，2014; Parrish et al。，2016; Penley et al。，2017）。我们感谢S. Scholz，M。Parmenter，J。Anderson和P. Phillips协助制定该协议。此外，我们感谢R. Parrish II，O。Schmidt，M。Allen和A. Khalid帮助完善该协议。我们还要感谢三位匿名审稿人改进这份手稿。 Emory大学为LTM提供了这项工作的资金。本研究中使用的一些线虫菌株由Caenorhabditis遗传学中心提供，该中心由NIH国家研究资源中心（NCRR）资助。作者声明他们没有利益冲突或竞争利益。

参考

Gray，J。C.和Cutter，A。D.（2014）。在实验进化中将 Caenorhabditis elegans 纳入主流。 Proc Biol Sci 281（1778）：20133055。
Lenski，R.E.，Rose，M.R.，Simpson，S.C。和Tadler，S.C。（1991）。 Escherichia coli的长期实验进化。 I.适应和2000年代的分歧。美国博物学家 138（6）：1315-1341。＆nbsp;
Morran，L。T.，Parmenter，M。D.和Phillips，P。C.（2009）。 Mutation负荷和快速适应有利于自我受精的异交。自然 462（7271）：350-352。
Morran，L。T.，Parrish，R。C.，2nd，Gelarden，I。A.，Allen，M。B. and Lively，C。M.（2014）。实验共同进化：寄生虫的快速局部适应取决于宿主交配系统。 Am Nat 184 Suppl 1：S91-100。＆nbsp;
Morran，L。T.，Schmidt，O。G.，Gelarden，I。A.，Parrish，R。C.，2nd and Lively，C。M.（2011）。与红女王一起运行：寄主 - 寄生虫共同进化选择双亲性行为。 Science 333（6039）：216-218。
Parrish，R。C.，2nd，Penley，M。J. and Morran，L。T.（2016）。遗传变异在 Caenorhabditis elegans异位进化中的不可或缺的作用 -Serratia marcescens 寄主 - 寄生虫系统。 P LoS 一个 11（4）：e0154463 ＆NBSP;
Penley，M。J.，Ha，G。T.和Morran，L。T.（2017）。细菌寄生虫选择秀丽隐杆线虫宿主防御的演变 Serratia marcescens 。 PLoS One 12（8）：e0181913。
Stiernagle，T。2006. 维护 C. C中的线虫。线虫研究社区，编辑。 WormBook： C的在线评论。线虫生物学。
Teotonio，H.，Estes，S.，Phillips，P。C. and Baer，C.F。（2017）。 Caenorhabditis 线虫的实验进化。 Geneti cs 206（2）：691-716。
Wiser，M。J.和Lenski，R。E.（2015）。测量 Escherichia coli 中适合度的方法的比较。 PL oS 开启 e 10（5）：e0126210。