材料和试剂

50毫升Falcon管（Corning，Falcon ®，目录号：352070）
1.5毫升Eppendorf Safe-Lock管（Eppendorf，目录号：0030120086）
移液器吸头，1,000μl和10μl体积（Corning，DeckWorks TM ，目录号：4124和4120）
无菌血清移液管，25 ml（Corning，目录号：4251）
1毫升无针注射器（BD，Luer-Lok TM ，目录号：303172）
4毫米不锈钢球（Mühlmeier）
6μm滤网（Bückmann，目录号：20000796）
30-32天龄拟南芥植物
Pseudomonas syringae pv。番茄 DC3000（ Pto ）
100％乙醇（VWR International，目录号：20821.321）
氯仿（Carl Roth，目录号：4432）
peqGOLD TriFast（VWR，PeqLab，目录号：30-2010）
苯酚溶液pH 8.0（Sigma-Aldrich，目录号：P4557）
无核酸酶水（未经DEPC处理）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，Ambion ®，目录号：AM9932）
三（2-羧乙基）膦（TCEP）（Sigma-Aldrich，目录号：C4706）
RNAqueous ® -Micro Total RNA Isolation Kit（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，Ambion ®，目录号：AM1931）
TURBO无DNA试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，Ambion ®，目录号：AM1907）
Ribo-Zero rRNA去除试剂盒（植物）（Illumina，目录号：MRZPL1224）
RNeasy Mini Kit（QIAGEN，目录号：74104）
Ovation ®完整的原核RNA-Seq DR多重系统（NuGEN Technologies，目录号：0326-32）
QIAGEN-tip 500（QIAGEN，目录号：10063）
液氮
NaOH（Carl Roth，目录号：6771）
细菌分离缓冲液（见食谱）

设备

Eppendorf参考移液器（Eppendorf，100-1,000μl）
Gilson PIPETMAN经典移液器（Gilson，型号：P20，目录号：F123600）
电动移液器（BrandTech Scientific，型号：accu-jet ® pro，目录号：26330）
冷冻离心机（Eppendorf，型号：5417 R和5810 R）
辊式搅拌机SRT1（Stuart Scientific，型号：SRT1）
涡旋混合器（科学工业，型号：Vort ex-Genie 2，目录号：SI-0236）
振动筛
热循环仪（DNA Engine Tetrad 2 Peltier热循环仪，Bio-Rad，型号：Tetrad 2）
NanoDrop TM One / One C 微量体积紫外 - 可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，型号：NanoDrop TM One C ，目录号：ND-ONE-W）
-80°C冰箱
高压灭菌器
通风柜
镊子（精细科学工具，型号：Dumont＃5，目录号：11251-10）
塑料刀具
剪刀
Illumina HiSeq-3000测序仪

软件

BowTie2
Python包HTSeq

程序

程序概述如图1所示。

图1.植物细菌转录组分析的工作流程摘要。该图采用了Nobori 等（2018）， PNAS 。叶子感染了 P.将丁香（syringae）粉碎并在细菌分离缓冲液中温育，然后过滤掉大的植物组织。然后将流过的血液离心以将细菌细胞与植物细胞分离。收获细菌细胞并进行RNA提取，cDNA文库制备和RNA-seq。

植物生长状况
使植物在22℃的室中生长10小时光照期和60％相对湿度24天，然后在另一个室中在22℃生长12小时光照期和60％相对湿度。光强度为约120μmol/ m 2， 2 / sec。三十到三十二天 A。使用拟南芥植物。
细菌分离（第1天）
注意：接触冷冻管时请使用防护设备。
1. 将细菌悬浮液（OD 600 = 0.5）浸入 A.从远轴侧用1ml无针注射器离开（4片叶/植物×20株植物，总共80片，约3g）拟南芥叶片。确保整个叶子区域渗入细菌。
2. 浸润6小时后，用镊子将80片叶子收集到含有8-10个不锈钢球（4毫米;用乙醇洗涤并风干）中的50毫升Falcon管中。用液氮快速冷冻。样品可以在-80°C下储存。
3. 用手彻底摇匀，将叶子压成小块（图2）。确保样品在压碎过程中不会解冻。
  
  图2.在细菌分离缓冲液中孵育之前的碎叶样品
4. 在通风橱中加入30ml冰冷的细菌分离缓冲液，立即涡旋10秒，然后用手剧烈摇动10秒。使用辊式混合器SRT1在4°C下以33rpm振荡孵育管20小时。
细菌分离（第2天）
注意：步骤C1-C7和D1-D12应在通风橱中完成。＆nbsp;
1. 装备50毫升猎鹰管，过滤器支架（由QIAGEN-tip 500柱手工制作;上半部分用塑料切割器切割;使用前高压灭菌）和单层6微米过滤网（切成12厘米x 15）厘米大小，然后高压灭菌）（图3）。用剪刀修剪多余的过滤网，使盖子适合管子。
  
  图3.配备50 ml Falcon管的过滤器和过滤器支架。 A.切割QIAGEN-tip 500色谱柱，制成过滤器支架。 B. 50毫升Falcon管，6微米滤网（12厘米×15厘米）和过滤器支架。 C.将50毫升Falcon管装上过滤器支架和滤网。 D.修剪掉多余的过滤网，使盖子能够与管子配合。＆nbsp;
2. 将样品（15毫升;不含不锈钢球）施加到柱上，并在4℃下通过以1,300 x g 离心10秒（或直到所有液体通过）过滤它。在保持管内流通的同时，将剩余的样品（15 ml）应用于色谱柱并重复过滤。
3. 取下过滤器和过滤器支架。在4℃下以3,200 x g 离心流过20分钟。用装有25ml血清移液管的电子移液管丢弃上清液。您可以留下一些液体（100μl）以避免样品丢失。
4. 加入900μl冰冷的细菌分离缓冲液并通过涡旋重悬沉淀，然后通过移液将其转移到冰上新的1.5ml管中。确保颗粒完全重悬。
5. 在4℃以2,300 x g 离心20分钟。您将看到两层颗粒：顶部为白色，底部为绿色（图4）。
  注意：有时管的上部变成淡绿色。在这种情况下，您可以通过用少量液相移液去除绿色部分并丢弃它以避免潜在的植物污染。
  
  图4.双层颗粒由植物（底部，绿色）和细菌（顶部，白色）组成
6. 装备20μlGilson移液器和10μl滤嘴（容量为20μl），并将体积设置为18μl。通过靠近颗粒表面上下移液，小心地仅重悬顶部白色层。当缓冲液被细菌细胞混浊时，使用1,000μl移液管将缓冲液（约1,000μl）转移到冰上新的1.5 ml管中。然后，小心地加入1毫升新的冰冷细菌分离缓冲液，不要通过平铺管破坏沉淀物。重复重新悬浮并在新的1.5 ml管中收集细菌细胞悬浮液（总共三次或直到白色层完全去除）。
  注意：
  1. 您可以使用适合移液器的较大吸头，但较小的吸头可以更容易地重悬细菌层而不会破坏植物层。
  2. 如果植物组织层塌陷并与细菌细胞层混合，您可以通过涡旋完全重悬浮整个沉淀然后重复离心步骤（步骤C5）来恢复细菌层。
7. 将细菌悬浮液在10,000 x g 下离心2分钟以收获细菌细胞。通过移液器丢弃上清液。
RNA提取
1. 每粒样品加入1毫升peqGOLD TriFast颗粒。例如，如果在步骤B6之后有3个试管，则向每个试管中加入333μlpeqGOLDTriFast，涡旋，并将它们合并在一个试管中。样品可以在-80°C下储存。
2. 每1ml peqGOLD TriFast加入200μl氯仿，涡旋，并在室温（RT）下离开管2分钟。
3. 在4℃以12,000 x g 离心15分钟。通过移液将含水部分（通常400-500μl）加入新的1.5ml Eppendorf管中。
4. 根据制造商的方案，使用RNAqueous ® -Micro总RNA分离试剂盒（Invitrogen，Ambion ®）分离RNA，并进行一些修改（见下文）。
5. 将洗脱液预热至75°C。
6. 向样品中加入半体积的100％乙醇并短暂涡旋。
7. 将样品（最多150μl）加载到Micro Filter Cartridge组件上。在室温下以12,000 x g 离心10秒。重复此步骤，直到加载所有样品。丢弃流通。
8. 将180μl洗涤液1加入Micro Filter Cartridge中。在室温下以12,000 x g 离心10秒。
9. 将180μl洗涤液2/3加入Micro Filter Cartridge中。在室温下以12,000 x g 离心10秒钟。
10. 再一次重复步骤C9。
11. 将微滤盒更换为新的收集管。在室温下以12,000 x g 离心1.5分钟以除去残留的流体并干燥过滤器。
12. 将Micro Filter Cartridge更换为新的1.5 ml Eppendorf管。用15μl预热的洗脱液洗脱RNA。再次将洗脱重复洗涤到同一管中（总共30μl）。
13. 根据制造商的方案，使用TURBO无DNA试剂盒（Ambion ®）进行DNA酶处理。
14. 使用NanoDrop检查RNA浓度。典型的RNA浓度为100-200 ng /μl。
植物来源的rRNA耗尽
遵循Ribo-Zero rRNA去除试剂盒（植物）的方案。如制造商的方案中所述，使用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）进行RNA纯化。典型的RNA产量为100-400ng。
图书馆准备和排序
1. 使用Ovation ®完全原核RNA-Seq DR多重系统（NuGEN）根据制造商的方案合成cDNA文库，并进行一些修改。
  重要提示：输入10 ng富含细菌的RNA，尽管该试剂盒推荐使用100-500 ng。这是因为你不能总是获得这种丰富的RNA。保持RNA输入量一致。
2. 使用Illumina HiSeq测序仪对文库进行测序。

数据分析

转录组的Illumina读数的定位和计数：

序列读数映射在 Pto 基因组上（可从 http://pseudomonas.com/ 获得）使用BowTie2（Langmead和Salzberg，2012）。将phred质量分数大于33的序列读数作为输入（命令：--phred33）。我们对其他参数使用默认设置。
使用Python软件包HTSeq（Anders et al。，2015）使用默认设置计算映射读数。 Pto 的基因注释文件（GFF3文件）可在 http://pseudomonas.com/。

笔记

苯酚和氯仿都是有毒的。将它们放在通风橱中并穿戴适当的保护装置。
在步骤D14中，RNA的质量趋于变化且通常较低。然而，在我们之前的实验中，这并没有引起数据重现性和RNA-Seq测量准确性的问题（Nobori et al。，2018）。

食谱

细菌分离缓冲液
无核酸酶水
25mM TCEP（三（2-羧乙基）膦），pH 4.5用10N NaOH调节
9.5％乙醇
0.5％苯酚溶液
注意：每次都准备好它。

致谢

该协议改编自先前发表的论文（Nobori et al。，2018）。这项工作得到了Max Planck Society和Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant SFB670（到K.T.）以及Nakajima Foundation（到T.N.）的博士后奖学金的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

1.Nobori，T.，Velasquez，A.C.，Wu，J.，Kvitko，B.H.，Kremer，J.M.，Wang，Y.，He，S.Y。和Tsuda，K。（2018）。植物免疫下细菌病原体的转录组景观。 Proc Natl Acad Sci美国 115（13）：E3055-E3064。
Anders，S.，Pyl，P。T.和Huber，W。（2015）。 HTSeq-用于处理高通量测序数据的Python框架。生物信息学 31（2）：166-169。
Langmead，B。和Salzberg，S。L.（2012）。与Bowtie 2进行快速读取对齐。 Nat方法 9（4）：357-35