材料和试剂

10厘米培养皿（康宁，目录号：430167）
手套（VWR International，目录号：82026）
防护服（VWR International，目录编号：414004-444）
眼镜（VWR International，目录号：89187-984）
人肿瘤细胞系：H1299（ATCC，目录号：ATCC ® CRL-5803 TM ）
Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（含L-谷氨酰胺的高葡萄糖）（Corning，目录号：10-013-CV）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（康宁，目录号：21-040-CV）
胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物学，目录号：S11150）
胸苷（Sigma-Aldrich，目录号：T9250）
碘化丙啶（PI）（赛默飞世尔科技，目录号：P3566）
抗体
1. 抗Cyclin A（Abcam，目录号：ab38）
2. 抗Cyclin D（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-753）
3. 抗β-肌动蛋白（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-58673）
Tris-HCl，pH 8.0（Thermo Fisher Scientific，目录号：15568025）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
NP-40（艾博抗（Abcam），目录号：ab142227）
EDTA（赛默飞世尔科技，目录号：15576028）
β-Mercaptoethanol（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
EBC细胞裂解缓冲液（见食谱）
电泳运行缓冲液（见食谱）
转移缓冲区（见食谱）

设备

细胞培养箱（VWR International，型号：98000-368）
流式细胞仪系统（BD，型号：FACSLyric）
X-RAY胶片处理器（柯尼卡美能达医疗保健美洲，型号：SRX-101A）

程序

在含有10毫升罗斯威尔公园纪念碑的10厘米培养皿（每皿2 x 10 6 -3 x 10 6 细胞）中以20-30％汇合的平板H1299细胞Institute（RPMI）1640培养基补充有10％胎牛血清（FBS）。
将细胞在37°C孵育过夜。
加入胸苷至终浓度为2mM。
在组织培养箱中于37℃培养细胞18小时。
通过加入10ml预热的1x PBS洗涤细胞并弃去PBS来除去胸苷。
加入10ml预热的新鲜培养基，在37℃的组织培养箱中孵育9小时。
加入第二轮胸苷至终浓度为2mM。
在37℃下在组织培养箱中培养细胞另外18小时。
细胞现在处于G1 / S边界。
通过用预热的1x PBS洗涤并在预热的新鲜培养基中孵育细胞来释放细胞。在0,2,6,8,10,12,14,24小时收集细胞用于通过使用PI的DNA染色分析细胞周期，或通过使用细胞周期蛋白A，细胞周期蛋白D和β-肌动蛋白抗体的蛋白质印迹分析蛋白质（图1）。

图1. G1 / S期同步H1299细胞在释放到新鲜培养基后进入正常细胞周期进展。 A.双胸苷阻断后释放后指定时间点的细胞周期谱。 B.释放后指定时间点细胞中细胞周期蛋白A，细胞周期蛋白B和β-肌动蛋白的表达水平。

数据分析

用Flowjo软件通过流式细胞术分析细胞周期（图1A）。通过蛋白质印迹检测细胞周期蛋白A，细胞周期蛋白B和β-肌动蛋白（图1B）。数据是三个独立实验的代表。

笔记

将胸苷溶解在PBS中并制备100mM储备溶液。
不同细胞周期阶段的时间点取决于不同细胞系的细胞周期进展时间。
碘化丙啶（PI）是一种诱变剂。应穿戴手套，防护服和眼镜。

食谱

EBC细胞裂解缓冲液
50mM Tris-HCl pH 7.6-8.0
120 mM NaCl
0.5％NP-40
1 mM EDTA
1mM Na 3 VO 4
50 mM NaF
1mMβ-巯基乙醇
电泳运行缓冲液
25mM Tris-HCl pH 8.3
192 mM甘氨酸
0.1％SDS
转移缓冲区
25mM Tris-HCl pH 8.3
192 mM甘氨酸
10％甲醇
细胞培养基
罗斯威尔公园纪念研究所（RPMI）1640中等
10％胎牛血清（FBS）

致谢

NIH / NCI拨款R01CA193828，R01CA136534和R01CA200905（X. Deng），Winship研究病理学和综合细胞成像共享资源以及埃默里大学Winship癌症研究所支持的Emory Comprehensive Glycomics Core（ECGC）支持这项工作。（P30CAJ 38292），由Winship Fashion颁发的治愈研究奖学金奖（给X. Deng），Winship提供的慈善奖，以及Winship捐赠基金（XD）。该协议改编自我们以前的工作（Chen et al。，2018）。

利益争夺

作者宣称不存在利益冲突。

参考

Chen，G.，Magis，AT，Xu，K.，Park，D.，Yu，DS，Owonikoko，TK，Sica，GL，Satola，SW，Ramalingam，SS，Curran，WJ，Doetsch，PW和Deng，X （2018年）。靶向Mcl-1可增强DNA复制应激对癌症治疗的敏感性。 J Clin Invest 128（1）：500-516。
Graña，X。和Reddy，E。P.（1995）。哺乳动物细胞的细胞周期控制：细胞周期蛋白，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs），生长抑制基因的作用和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKIs）。 Oncogene 11（2）：211-219。
Ho，Y.S。，Duh，J。S.，Jeng，J。H.，Wang，Y.J.，Liang，Y.C.，Lin，C.H。，Tseng，C.J。，Yu，C.F.，Chen，R.J。和Lin，J.K。（2001）。灰黄霉素通过诱导人结直肠癌细胞凋亡和G2 / M细胞周期阻滞增强诺考达唑的抗肿瘤发生作用细胞。 Int J Cancer 91（3）：393-401。
Koç，A.，Wheeler，LJ，Mathews，CK和Merrill，GF（2004）。 Hydroxyurea通过保留基础dNTP池的机制阻止DNA复制。 J Biol Chem 279（1）：223-230。
Léger，K.，Hopp，A.K.，Fey，M。和Hottiger，M。O.（2016）。 ARTD1调节细胞周期蛋白E的表达，从而调节细胞周期再入和T24膀胱的G1 / S进展癌细胞。细胞周期 15（15）：2042-2052。
Rodríguez-Ubreva，F。J.，Cariaga-Martinez，A。E.，Cortés，M。A.，Romero-De Pablos，M.，Ropero，S.，López-Ruiz，P。andColás，B。（2010）。敲除蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1通过调节前列腺癌细胞抑制G1 / S进展细胞周期机制的组成部分。 Oncogene 29（3）：345-355。
Sakaue-Sawano，A.，Kurokawa，H.，Morimura，T.，Hanyu，A.，Hama，H.，Osawa，H.，Kashiwagi，S.，Fukami，K.，Miyata，T.，Miyoshi，H 。，Imamura，T.，Ogawa，M.，Masai，H。和Miyawaki，A。（2008）。可视化多细胞细胞周期进展的时空动态。细胞 132（3）：487-498。
Schvartzman，J.B.，Krimer，D.B。和Van't Hof，J。（1984）。不同胸苷浓度对豌豆根细胞DNA复制的影响同步延长的5-氟脱氧尿苷治疗。 Exp Cell Res 150（2）：379-389。