材料和试剂

神经元细胞沉淀
生物素5'端标记和未标记的DNA探针（竞争）（Integrated DNA Technologies）
表S- EMSA探针的序列
带正电荷的尼龙膜（Sigma-Aldrich，目录号：Z670197）
Tris碱
硼酸
EDTA
BSA
Poly（dIdC）（0.5μg/μl）（Pierce Antibodies，目录号：20148）
抗体（ab1437）
5x加样缓冲液（QIAGEN，目录号：1037650）
X光片
高品质吸墨纸（Whatman，目录号：3030-931）
聚丙烯酰胺凝胶在0.5×TBE中
细胞质提取缓冲液（NE-PER核和细胞质提取试剂盒）（Pierce Antibodies，目录号：78835）
洗涤缓冲液（LightShift Chemiluminescent EMSA试剂盒）（Pierce Antibodies，目录号：20148）
核提取缓冲液（NE-PER核和细胞质提取试剂盒）（Pierce Antibodies，目录号：78835）
2x反应缓冲液（LightShift Chemiluminescent EMSA试剂盒）（Pierce Antibodies，目录号：20148）
丙烯酰胺
双丙烯酰胺
TBE缓冲区
TEMED
过硫酸铵
磷酸酶抑制剂
6％非变性PAGE凝胶（见配方）
5x TBE（pH 8.3）（参见配方）

设备

离心机
UV灯或装备有254nm灯泡或312nm透射仪的交联装置
电泳仪
电凝器或毛细管转移装置
1.5 ml微量离心管

程序

准备神经元的核蛋白提取物
1. 在1.5ml微量离心管（DIV14原代培养神经元来自小鼠E16.5皮层）中收集1-5×10 6个神经元沉淀。
2. 重悬浮神经元在200微升细胞质提取缓冲液中的蛋白酶和磷酸酶抑制剂，并保持在冰上10分钟打破细胞膜。
3. 在4℃下以16,000×g离心5分钟以分离具有胞质组分的细胞核（通过核/细胞质蛋白标记物-HDAC1和HSP90测试级分质量）。
4. 除去上清液作为细胞质提取物
5. 用300μl洗涤缓冲液洗涤核沉淀。
6. 在4℃下将细胞以16,000×g离心10分钟以沉淀核。
7. 将核沉淀重悬在100μl核提取缓冲液中，将裂解物等分到10μl/管中
8. 在-80℃下冻干核提取物。
9. 测量蛋白质浓度，并用提取缓冲液调整至1μg/μl，用于凝胶迁移测定
准备和预运行凝胶
1. 在0.5x TBE中制备天然PAGE凝胶。合适的聚丙烯酰胺百分比取决于靶DNA和结合蛋白的大小。大多数系统在0.5x TBE中使用4 -6％PAGE凝胶
2. 将凝胶放置在电泳单元中。用0.5×TBE填充内室至高于孔顶部几毫米的高度。将0.5x TBE的罐外部填充到孔底部，这样可以减少电泳过程中的热量。冲洗孔并在100V下预凝胶电泳30-60分钟。
执行结合反应
1. 2×反应缓冲液12μl
2. BSA（1μg/μl）3μl
3. Poly（dIdC）（0.5μg/μl）2μl
4. 核提取物（1μg/μl）3μl（作为对照的细胞质提取物）
5. dH 2 O3μl。
6. 保持在室温或在冰上10分钟无抗体，20分钟与抗体; 继续旋转（选项）。
7. 加入生物素标记的DNA探针（20fmol /反应）
8. 在室温下保持20分钟。
电泳结合反应
1. 向每个20μl结合反应中加入5μl5x上样缓冲液，上下吹打数次混匀。在200V运行凝胶1-1.5小时。使用泳道1中的DNA上样缓冲液作为游离探针的指示剂。游离探针通常以与DNA上样缓冲液的蓝色染料相同的迁移率运行。当染料在距离底部3cm处停止时停止凝胶。
尼龙膜结合反应的电泳转移
1. 在0.5×TBE中浸泡尼龙膜15分钟
2. 在干净的电泳转移装置中将凝胶，尼龙膜和吸墨纸夹在中间
3. 在380mA（〜100V）下转移30分钟。
4. 当转印完成后，将其放在干纸巾上1-3分钟。
交联将DNA转移到膜和检测
1. 10-15分钟，膜面向下放在装有312nm灯泡的透照器上
2. 膜交联后，直接进入LightShift Chemiluminescent检测试剂盒。或者，膜可以在室温下干燥储存几天

食谱

6％非变性PAGE凝胶例如，使50ml体积凝胶：
7.5ml 40％丙烯酰胺 5ml 2％双丙烯酰胺 2.5ml 10x TBE缓冲液
50μlTEMED
0.5ml 10％过硫酸铵 34.5ml dH 2 O 2 /
5x TBE（pH 8.3）
450 mM Tris
450mM硼酸 10 mM EDTA

致谢

该协议改编自Li等人（2012）。

参考文献

Li，J.，Chen，J.，Ricupero，C.L.，Hart，R.P.，Schwartz，M.S.，Kusnecov，A.and Herrup，K。（2012）。 HDAC4在ATM缺陷中的核积累可促进共济失调毛细血管扩张症中的神经变性。 Med 18（5）：783-790。