材料和试剂

1.7毫升Eppendorf离心管（Corning，Axygen ®，目录号：MCT-175-C）
注射器
1毫升（CODAN，目录号：621640）
5毫升（CODAN，目录号：625607）
20毫升（CODAN，目录号：627602）
注射器针头（Henke-Sass，Wolf，目录号：4710005016）
用于厌氧细菌培养的1,000,500,100和50 ml血清瓶（DWK Life Sciences，Wheaton，目录号：W012467A [100 ml]）
100毫升含大瓶颈的血清瓶（默克，目录号：STBMRFA12）
血清瓶用橡胶塞（VWR，特殊要求）
用于血清瓶的金属盖（Thermo Fisher Scientific，目录号：C4020-3A）
血清瓶密封压接器（DWK Life Sciences，Wheaton，目录号：224322）
0.2μm无菌过滤器（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
96孔聚丙烯微孔板（SARSTEDT，目录号：82.1581）
带盖的96孔微量离心管鳍架（Fisher Scientific，目录号：11710344）
Desulfitobacterium hafniense 菌株TCE1（Gerritse et al。，1999）
Desulfitobacterium hafniense 菌株LBE（Comensoli et al。，2017）
乙醇（Thommen Furler，目录号：180-VL54K）
腐蚀铁试样（在瑞士苏黎世市户外暴露后产生天然腐蚀层的钢试样）
粘合碳带12 mm x 20 m（Agar Scientific，目录号：AGG3939A）
N 2 气瓶（Carbagas，目录号：I4001）
NH 4 HCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：A6141）
NaHCO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：S5761）
K 2 HPO 4 •3H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：P5504）
NaH 2 PO 4 •2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：71505）
蛋白胨（BD，目录号：211677）
刃天青钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：R7017）
Cyanocobalamin（Acros Organics，目录号：405920010）
核黄素（Sigma-Aldrich，目录号：R4500）
盐酸硫胺素（AppliChem，目录号：A0955）
生物素（Thermo Fisher Scientific，Alfa Aesar，目录号：A14207）
对氨基苯甲酸盐（钠盐）（Sigma-Aldrich，目录号：A9878）
泛酸（钠盐）（西格玛奥德里奇，目录号：P3161）
叶酸•2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：F7876）
硫辛酸（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：62320）
盐酸吡哆醇（Acros Organics，目录号：150770500）
烟酸（Sigma-Aldrich，目录号：N4126）
EDTA二钠盐•2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：E1644）
FeCl 2 •4H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：44939）
MnCl 2 •4H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M3634）
CoCl 2 •6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C8661）
ZnCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：793523）
CuCl 2 •2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：C3279）
AlCl 3 （Sigma-Aldrich，目录号：237051）
H 3 BO 3 （Sigma-Aldrich，目录号：B6768）
Na 2 MoO 4 •2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：331058）
NiCl 2 •6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：N6136）
CaCl 2 •2H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：223506）
MgCl 2 •6H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M2393）
Na 2 S•9H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：208043）
DL-乳酸钠60％溶液（Sigma-Aldrich，目录号：L1375）
富马酸二钠（Sigma-Aldrich，目录号：F1506）
HCl 37％（S-20）（Honeywell International，目录号：30721-1L-GL）
MilliQ水
Fe（II） - 硫酸铵（Honeywell International，Fluka，目录号：09720）
Fe（III） - 柠檬酸盐（Sigma-Aldrich，Fluka，目录号：44941-250G）
4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸，N-（2-羟乙基）哌嗪-N' - （2-乙磺酸）（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375-250G）
NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：71690）
针铁矿：α-FeO（OH）（西格玛奥德里奇，目录号：71063-100G）（固体Fe（III） - 相对于akaganeite的替代来源）
Fe 2 O 3 （Sigma-Aldrich，目录号：529311-5G）（固体Fe（III） - 相到akaganeite的替代来源）
D的生长培养基。 hafniense （见食谱）
1. N 2 - 脱气H 2 O＆nbsp;
2. 无菌血清瓶
3. DL-乳酸钠溶液40％（v / v）
4. 富马酸二钠溶液16％（v / v）
5. 还原剂溶液1 M.
6. 刃天青溶液0.5克/升
7. 维生素溶液1
8. 维生素溶液2
9. 维生素溶液3
10. 维生素溶液4
11. 微量元素解决方案
12. 碳酸盐溶液
13. 溶液A（基础培养基）
14. 溶液B（维生素溶液）
15. 解决方案C（缓冲/还原溶液）
16. 解决方案D.
可溶性柠檬酸铁（III）（35克/升） - 100毫升（见食谱）
1. HCl溶液调节pH值
2. NaOH溶液调节pH值
3. Fe（III）溶液
固体Fe（III）悬浮液（见食谱）
1. 固体Fe（III）源
2. 制备固体Fe（III） - 相（akaganeite或针铁矿）的悬浮液
Ferrozine ®试剂（见食谱）
1. HCl溶液5M
2. Fe（II）1M的储备溶液用于校准曲线
3. Ferrozine ®试剂

设备

1升刻度烧瓶（SciLabware，目录号：1132/26）
磁棒（Sigma-Aldrich，BRAND，目录号：Z328774，Z328812）
不锈钢刮刀（Sigma-Aldrich，目录号：HS15909）
Balance（Mettler-Toledo International，目录号：PG5002）
P20移液器（Gilson，产品目录号：F123600）
P200移液器（Gilson，目录号：F123601）
P1000移液器（Gilson，产品目录号：F123602）
pH计
本生灯（FIREBOY Plus）（Integra Biosciences，目录号：144000）
高压灭菌器（Fedegari Autoklav FOB5 / TS）（VITARIS，目录号：260000-FED，序列号：NBD801AV）
轨道振动筛（Kühner，型号：SMX1200）
电炉和磁力搅拌器（Heidolph Instruments，目录号：MR2002）
Spinbar ®磁力搅拌棒（Sigma-Aldrich，SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instrument，目录号：Z126942-1EA）
分光光度计比色皿（Sigma-Aldrich，目录号：C5291-100EA）
紫外可见分光光度计（GENESYS TM 10S）（Thermo Fisher Scientific，目录号：840-208100）
酶标仪（Biochrom，Asys Hitech，目录号：UVM 340）
pH计（台式仪表AE150）（Fisher Scientific，目录号：15524693）
生物安全柜配备254 nm紫外灯（Azbil Telstar，目录号：Bio II Advance）
化学通风橱
干燥器（BRAND，目录号：65815）
扫描电子显微镜（SEM）（飞利浦ESEM XL30 FEG环境扫描电子显微镜配备能量色散X射线分析仪（飞利浦）
拉曼显微镜（HORIBA，JOBIN YVON，LabRAM Aramis显微镜，配备Nd：YAG激光，波长为532 nm，由LabSpec NGS光谱软件控制.HORIBA，JOBIN YVON，目录号：LabRAM Aramis，3个激光器和xyz阶段）
涡流
真空泵
冰箱

程序

生物质生产
1. 根据要研究的细菌菌株的数量，需要估计培养基的体积和血清瓶的数量。始终包括非生物控制。测试 D菌株TCE1和LBE的能力。 hafniense ，准备3瓶不同的培养基（非生物对照，菌株TCE1和菌株LBE）。对于组合物，参见配方点B. D. hafniense的生长培养基。
2. 使用正常生长培养基为 D制备接种物。 hafniense 并在标准条件下（30°C，100rpm搅拌下）孵育细菌菌株约3天。＆nbsp;
3. 接种物的最终OD 600 应在0.1-0.15的范围内。为了验证OD 600 ，使用无菌注射器从培养物中取出1ml样品，并将其转移到分光光度计比色皿中。测量OD 600 。＆nbsp;
4. 使用无菌注射器，将无菌40ml接种物（5％）加入800ml生长培养基中。对于该体积，需要1L血清瓶（图2）。
  
  图2.显示生产细菌生物质的接种程序的方案
5. 将培养物在30℃下在100rpm的搅拌下孵育直至在两种菌株的OD 600 0.12和0.18之间孵育。
与铁源孵化
1. 在N 2 气氛中准备所需数量的空的50ml无菌血清瓶（参见配方2）。包括每个铁源，使用的菌株和非生物控制的一式三份。高压灭菌。
2. 要密封标准血清瓶，请插入橡胶塞并用带有空心开口的金属盖盖住。当密封时，中空开口允许在实验期间用注射器取样。最后，使用密封压接器将金属帽系在一起并固定在血清瓶上。＆nbsp;
3. 对于菌株LBE和TCE1的实验，在N 2 气氛中制备18个空的50ml无菌血清瓶。
4. 在9个空瓶中，无菌加入1.5ml柠檬酸铁（III）溶液（见食谱）。在其他9个瓶中加入无菌1.5毫升的akageneite悬浮液（见食谱）。
5. 为了测试腐蚀的试样上的细菌减少，通过喷洒70％乙醇溶液（v / v）对9个腐蚀的试样进行灭菌，然后在无菌条件下暴露于UV辐射（每侧20分钟，254nm）。在生物安全柜内执行灭菌程序。
6. 在具有大瓶颈的血清瓶中添加9个试样，密封瓶子，抽空顶部空间并使用N 2 替换大气。高压灭菌。
7. 一旦所有瓶子都经过高压灭菌（步骤B1和B6），无菌添加20毫升无菌培养基（非生物对照）或程序A中制备的生物质。对不同的铁源（Fe（III）进行操作 - 柠檬酸盐，akageneite，铁优惠券）。计算这些比例以获得起始浓度为10mM的可溶性和固态Fe（III）相的培养物。在使用腐蚀的优惠券修改的文化中，铁浓度未知。
8. 为了使细菌和铁源充分混合，将血清瓶在30℃下在100rpm的搅拌下孵育。孵育瓶子直至形成黑色沉淀（与 D.hafniense 孵育7天）。在培养期间，培养基在用可溶性柠檬酸铁（III）和碱金属盐悬浮液修饰的培养物中从橙色/绿色变为黑色。黑色沉淀物的形成是铁还原的指示。在用铁试样修正的培养物中可以观察到相同的现象，因为试样和介质的表面变黑。
9. 在孵育7天期间，每天从每次处理中收集0.5ml上清液样品并复制。确保采取有代表性的样本。当形成黑色沉淀物时，将注射器的针头插入血清瓶的橡胶塞中。翻倒血清瓶。轻轻摇动，收集0.5毫升样品。＆nbsp;
10. 将样品转移到1.7毫升Eppendorf管中。＆nbsp;
11. 向所有管中加入50μl5MHCl。
12. 通过涡旋混合5秒并在室温下孵育15分钟。该步骤将允许通过酸（HCl）溶解铁并防止Fe（II）离子的氧化。
13. 在-20°C冷冻所有样品。
确认铁减少
1. 用分光光度法定量测定Fe（II）
  Ferrozine ®试剂在与Fe（II）反应时会变成紫色。颜色强度与Fe（II）的浓度成比例。然后，执行校准曲线可以量化样品中的Fe（II）含量。
  1. 打开酶标仪，将波长设置为562 nm。
  2. 从冰箱中取出校准曲线的标准溶液（参见食谱）。＆nbsp;
  3. 在室温下定量Fe（II）之前解冻从培养物中取出的冷冻样品（步骤B9-B12）。
  4. 通过涡旋混合5秒。
  5. 将10μl反应混合物（标准溶液或样品）转移至96孔微量培养板中。
    注意：取样时，确保在移液前将它们与涡旋混合均匀。
  6. 在微孔板孔中加入90μl的Ferrozine ®试剂。＆nbsp;
  7. 不要忘记使用 D的标准生长培养基进行空白样品。。hafniense ＆NBSP;
  8. 使用酶标仪在接下来的2分钟内测量562 nm处的吸光度。如果吸光度值高于校准曲线中浓度较高的样品的值（在我们的情况下，对于1000μM标准品为0.239 nm），则从原始样品开始准备相应样品的稀释液，并重复步骤C1d中的测量值＆NBSP;
  9. 测量每个重复，并为每个样本执行2-3个测量。
2. Fe（II） - 生物矿物的表征
  1. 当培养物变黑并观察到沉淀时，从培养物中取出试样并通过喷洒70％乙醇溶液（v / v）对其进行灭菌，然后暴露于UV辐射（每侧20分钟）。用细菌 D。 hafniense ，7天后可以从血清瓶中取出优惠券。
  2. 将处理过的试样在真空下储存在干燥器中，以避免在实验过程中产生的生物矿物的氧化态发生变化。
  3. 为了研究新形成的生物矿物的形态，分布和元素组成，通过简单地将它们放置在显微镜室内来用SEM分析试样。要将试样固定到样品架，请使用如图3所示的碳带。以10-25 keV的加速电位观察二次电子模式下的样品。
    
    图3.带有试样和碳带的样品架，为SEM分析准备
  4. 为了研究新形成的Fe（II） - 生物矿物的分子组成，直接在试样表面上进行拉曼光谱分析。为此，只需将优惠券放在最低物镜下，并专注于要分析的区域。更改目标并再次聚焦，直到达到400倍放大率。使用以下设置获得高质量光谱并避免样品表面燃烧：激光在532 nm，功率低于1 mW（600 g / mm），光谱间隔在100和1,600 cm 之间 - 1 和1,000μm孔，100μm狭缝和5次累积100秒。

数据分析

以Mn计算Fe（II）含量
使用以μM为单位的校准曲线转换Fe（II）浓度的吸光度值，如图4所示。仅考虑校准曲线范围内的吸光度值（在我们的情况下介于0.011和0.239之间）。如果测得的吸光度低于此值，则将Fe（II）含量视为0μM。如果值较高，请稀释原始样品并重复测量，直到吸光度在校准曲线的线性范围内。

图4.使用Ferrozine ®反应物定量Fe（II）的程序。 A.校准曲线的示例。在左边是一个带有数字数据的表格;在右边，显示了显示校准曲线的方程和相关系数的相应图表。数据代表重复的平均值。吸光度的增加在50和1,000μM之间是线性的，相关系数是0.9999。 B.数据处理的例子。在左侧，显示了从校准曲线外推的等式，在右侧，给出了数据处理的示例。数据来自非生物对照，用在第0天取样的柠檬酸铁（II）修正。

当所有吸光度值转换为Fe（II）含量时，数据可以直方图显示，如图5所示。

图5.使用Ferrozine ®测定法定量Fe（II）含量。图表表示非生物对照中的Fe（II）含量以及用可溶性Fe修饰的培养物中的Fe（II）含量（III） - 由校准曲线计算的 - 柠檬酸盐（左）和固体Fe（III）（右）。
生物矿物的表征
可以通过观察SEM显微照片直接研究生物晶体的形态。为了识别新形成的生物矿物，将获得的光谱（记录在处理过的试样表面上）与软件库中的参考光谱以及文献中提供的拉曼位移进行比较（Frost et al。，2002; Monnier et al。，2011;Rémazeilles et al。，2013）。图6显示了用 D处理的腐蚀试样获得的结果的实例。 hafniense 菌株TCE1和LBE。

图6.用 D培养物处理的腐蚀铁试样的铁还原试验。 hafniense 菌株TCE1和LBE。 A.新形成的生物矿物的形态学。左栏：优惠券的外观;右栏：在优惠券图片上由黑色方块表示的区域中拍摄的相应SEM图像。 B.孵育后试样表面的分子组成。左栏：通过拉曼光谱分析的区域（黑色方块）;和右列：相应的拉曼光谱。矿物质被鉴定为：1：纤铁矿（Le），2：结晶不良的mackinawite（M）和元素硫（S）的混合物，3：Vivianite（Vi），和4：vivianite（Vi）和纤铁矿（Le）的混合物。

笔记

再现性
收集培养样品是一个微妙的步骤。事实上，由于在培养期间形成铁沉淀物，因此难以收集代表性样品。因此，在对培养物进行取样之前，确保将它们混合均匀，否则样品中的铁含量将无法代表。
非生物控制
用于培养厌氧细菌的培养基通常很复杂并且含有还原剂，例如Na 2 S.因此，为了排除Fe（III）的非生物减少，必须用所有测试的铁源进行非生物控制。
Ferrozine ®试剂
含有Ferrozine ®试剂和样品的混合物的强度随时间而变化。因此，重要的是在孵育2分钟后精确测量吸光度，并对所有样品使用相同的程序。
储存经过处理的优惠券
新形成的生物矿物的稳定性尚不清楚。因此，在用拉曼光谱法进行鉴定之前，将铁试样存放在干燥器中，以避免在处理过程中产生的生物矿物的氧化状态发生变化。

食谱

D的生长培养基。 hafniense
1. N 2 - 脱气H 2 O
  1. 煮沸，500毫升MilliQ水，加热板搅拌器
  2. 在N 2 下冷却，将80 ml分配到血清瓶中，气体交换为N 2 ，高压灭菌器（120°C，20分钟）
  3. 在室温下储存长达12个月
2. 无菌血清瓶
  N 2 和高压釜的气体交换
  在室温下储存长达12个月
3. DL-乳酸钠溶液40％（v / v）
  1. 用MilliQ水将60％的储备溶液稀释至40％
  2. 将100ml分配至血清瓶，气体交换N 2 ，高压灭菌
  3. 储存在4°C至12个月
4. 富马酸二钠溶液16％（v / v）
  1. 将80g富马酸二钠加入500ml MilliQ水中
  2. 将100ml分配至血清瓶，气体交换N 2 ，高压灭菌
  3. 在室温下储存长达12个月
5. 还原剂溶液1 M
  1. 用N 2 -degassed H 2 O洗涤Na 2 S•9H 2 O的晶体以除去已经氧化部分的晶体
  2. 用薄纸干燥晶体
  3. 重量24.02克该化合物（干重）
  4. 将其溶于100毫升脱气的MilliQ水中
  5. 使用0.2μm过滤器过滤灭菌到血清瓶中
  6. N 2 的气体交换
  7. 储存在4°C至12个月
6. 刃天青溶液0.5 g / L
  将0.1g刃天青钠盐加入200ml MilliQ水中储存在4°C至12个月
7. 维生素溶液1
  1. 在1升MilliQ水中加入250毫克氰钴胺素
  2. 过滤灭菌到无菌血清瓶中，气体交换N 2
  3. 储存在4°C至12个月
8. 维生素溶液2
  1. 在1升MilliQ水中加入50毫克核黄素
  2. 过滤灭菌到无菌血清瓶中，气体交换N 2
  3. 储存在4°C至12个月
9. 维生素溶液3
  1. 向1升MilliQ水中加入100毫克硫胺素 - 盐酸盐
  2. 过滤灭菌到无菌血清瓶中，气体交换N 2
  3. 储存在4°C至12个月
10. 维生素溶液4
  1. 将所有组分添加到1L MilliQ水中
    50毫克生物素
    250毫克对氨基苯甲酸盐（钠盐）
    50毫克泛酸（钠盐）
    20毫克叶酸•2H 2 O
    50毫克硫辛酸
    100毫克吡哆醇盐酸盐
    550毫克烟酸
  2. 用0.2μm过滤器过滤灭菌到无菌血清瓶中，对N 2 进行气体交换
  3. 储存在4°C至12个月
11. 微量元素解决方案
  1. 将500毫克EDTA溶于900毫升MilliQ水中，用HCl调节pH至7.0，然后加入以下化合物：
    2毫克FeCl 2 •4H 2 O
    100mg MnCl 2 •4H 2 O
    190mg CoCl 2 •6H 2 O
    70毫克ZnCl 2
    2.55mg CuCl 2 •2H 2 O
    5.52毫克AlCl 3
    6mg H 3 BO 3
    41.4毫克Na 2 MoO 4 •2H 2 O
    24毫克NiCl 2 •6H 2 O.
  2. 将MilliQ水加入1升
  3. 储存在4°C至12个月
12. 碳酸盐溶液
  1. 将9.01克NH 4 HCO 3 和76.11克NaHCO 3 加入1升MilliQ水中
  2. 煮沸，在N 2 / CO 2 （4：1）下冷却，向每个血清瓶分配49 ml，气体交换为N 2 / CO 2 （4：1），高压灭菌器
  3. 在室温下储存长达12个月
13. 溶液A（基础培养基）
  1. 将所有组分添加到1L MilliQ水中：
    0.958克K 2 HPO 4 •3H 2 O
    0.218克NaH2PO 4 •2H 2 O
    0.1克蛋白胨
    1ml刃天青溶液0.5g / L.
  2. 煮沸，在N 2 / CO 2 （4：1）下冷却，分配到血清瓶中，气体交换为N 2 / CO 2 （4：1），高压灭菌器
  3. 在室温下储存长达12个月
14. 溶液B（维生素溶液）
  向20毫升厌氧无菌MilliQ水中，用注射器无菌添加以下溶液：
  1毫升微量元素溶液
  1毫升维生素溶液1
  1毫升维生素溶液2
  1毫升维生素溶液3
  1毫升维生素溶液4
  储存在4°C至3个月
15. 解决方案C（缓冲/还原溶液）
  向49毫升碳酸盐溶液中加入1毫升还原剂溶液储存在4°C至3个月
16. 解决方案D
  1. 加入4.40克CaCl 2 •2H 2 O和4.06克MgCl 2 •6H 2 O至1 L MilliQ水
  2. 在血清瓶中分配200ml，用于N 2 的气体交换和高压灭菌
  3. 储存在4°C至12个月
生长培养基完成
向45 ml溶液A中，用注射器无菌添加以下成分：
1.25毫升溶液B
2毫升溶液C
1.25毫升溶液D
1毫升乳酸盐溶液
1毫升富马酸盐溶液
pH值应介于7.0和7.6之间为了验证pH值，用注射器收集1 ml样品并在pH计上测量
可溶性柠檬酸Fe（III）（35 g / L） - 100 ml
1. HCl溶液调节pH值
  1. 用MilliQ水填充100ml带刻度量瓶的一部分
  2. 将41.5毫升HCl 37％
  3. 用MilliQ水填充至100毫升
  4. 进行稀释以获得从5 M（起始溶液）到0.01 M的浓度范围
  5. 在室温下储存长达6个月
2. NaOH溶液调节pH值
  1. 将20g NaOH颗粒溶解在100ml MilliQ水中
  2. 进行稀释以获得从5 M（起始溶液）到0.01 M的浓度范围
  3. 在室温下储存长达6个月
3. Fe（III）溶液
  1. 将3.5g柠檬酸铁（III）溶于100ml milliQ水中。为了促进溶解，添加磁棒并在80℃下用磁力搅拌器混合溶液。此步骤可能需要1-2小时。当粉末完全溶解时，不应看到残留的颗粒，溶液的颜色变为黄色，pH值极差（pH 1-2）
  2. 通过添加NaOH滴将溶液的pH调节至7。在此过程之后，溶液变成棕橙色
  3. 用不可磨灭的笔除去氧标记，烧瓶中的溶液水平，向溶液中加入额外的MilliQ水，让溶液沸腾，直到所有添加的水都蒸发掉（帮助自己用笔痕检测原始体积解决方案）。然后通过冲洗N 2 / CO 2 冷却溶液，并使用血清瓶密封压接器用橡胶塞和金属盖密封血清瓶。通过高压灭菌（120℃，20分钟）对溶液灭菌。
  4. 储存在4°C至6个月
固体Fe（III）悬浮液
1. 固体Fe（III）源
  1. 在最初的实验中，使用了akaganeite（FeO 0.833 （OH） 1.167 Cl 0.167 ）。 Akaganeite由瑞士国家博物馆提供。按照Schwertmann和Cornell（2008）的方案合成该化合物。然而，对于该测试，可以使用任何种类的不溶性Fe（III） - 氧化物或Fe（III） - 羟基氧化物来制备悬浮液（即，Fe 2 O 3 或α-FeO（OH），Sigma-Aldrich）
  2. 储存在4°C至6个月
2. 制备固体Fe（III） - 相（akaganeite或针铁矿）的悬浮液
  1. 对于akaganeite悬浮液（10 g / L - 100 ml）：
    将1.0g的akaganeite加入100ml MilliQ水中
  2. 对于针铁矿悬浮液（13 g / L - 100 ml）：
    在100毫升MilliQ水中加入1.3克针铁矿
  3. 控制悬浮液的pH并用HCl或NaOH溶液滴加至pH7
  4. 重复已经描述的制备可溶性Fe（III）溶液的所有步骤，以除去氧气并对溶液进行灭菌
  5. 储存在4°C至6个月
Ferrozine ®试剂
1. HCl溶液5 M
  先前描述的相同程序（B1。用于调节pH的HCl溶液）
2. Fe（II）1M的储备溶液用于校准曲线
  1. 用HCl（5 M）清洗1升的刻度瓶
  2. 用MilliQ水清洗
  3. 填充部分MilliQ水
  4. 加入41.55毫升37％的HCl（S-20）
  5. 加入392.14mg硫酸铁铵（II）
  6. 用MilliQ水填充高达1升
  7. 稀释储备溶液以获得以下浓度：50,100,250,500,750和1,000μM。
  8. 分装并储存在4°C至6个月（避光）
3. Ferrozine ®试剂
  1. 用HCl（5 M）清洗1升的刻度瓶
  2. 用MilliQ水清洗
  3. 填充部分MilliQ水
  4. 加入11.9毫升HEPES缓冲液（终浓度50 mM）
  5. 用MilliQ水清洗烧瓶壁
  6. 加入1克Ferrozine ®
  7. 用MilliQ水填充高达1升
  8. 用NaOH溶液调节pH至7
  9. 储存在4°C至2个月

致谢

作者感谢瑞士国家科学基金会的Ambizione资助（PZ00P2_142514,2013-2016，Pi：Edith Joseph）。作者还要感谢瑞士国家博物馆的研究保护实验室，以帮助进行拉曼调查（Marie Woerle博士和Tiziana Lombardo博士），并提供实验中使用的铁券。
该协议是Comensoli 等人描述的方法的修改版本（2017）。此外，培养基的组成改编自Gerritse et al。（1999），而Ferrozine ®测定用于量化液体溶液中的Fe（II）离子改编自Stookey（1970）。

利益争夺

作者没有利益冲突或竞争利益申报。

参考

Bosch-Roig，P。和Ranalli，G。（2014）。文化遗产生物清洁技术的安全性。 Front Microbiol 5：155。
Cappitelli，F.，Toniolo，L.，Sansonetti，A.，Gulotta，D.，Ranalli，G.，Zanardini，E。和Sorlini，C。（2007）。使用微生物技术优于传统化学技术从历史古迹石材表面去除黑壳的优势。 Appl Environ Microbiol 73（17）：5671-5675。
Cappitelli，F.，Zanardini，E.，Ranalli，G.，Mello，E.，Daffonchio，D。和Sorlini，C。（2006）。通过使用硫酸盐还原菌改进历史石材艺术品上黑壳的生物去除方法。 Appl Environ Microbiol 72（5）：3733-3737。
Comensoli，L.，Maillard，J.，Albini，M.，Sandoz，F.，Junier，P。和Joseph，E。（2017）。使用细菌来稳定考古铁。 Appl Environ微生物 83（9）。
Fortune，W。B.和Mellon，M。G.（1938）。用邻菲啰啉测定铁：分光光度研究。 Ind Eng Chem 10（2）：60-64。
Frost，R。L.，W。Martens，P。Williams。和J. T. Kloprogge。（2002年）。 vivianite-group磷酸盐vivianite，baricite和bobierrite的拉曼和红外光谱研究。 Mineral Mag 66（6）：1063-1073。
Gerritse，J.，Drzyzga，O.，Kloetstra，G.，Keijmel，M.，Wiersum，L.P.，Hutson，R.，Collins，M.D。和Gottschal，J.C。（1999）。不同电子供体和受体对四氯乙烯对脱硫细菌的影响 Desulfitobacterium frappieri TCE1。 Appl Environ Microbiol 65（12）：5212-5221。
Jonkers，H。M.（2011）。基于细菌的自愈合混凝土。苍鹭56（1/2）
Joseph，E.，Cario，S.，Simon，A.，Worle，M.，Mazzeo，R.，Junier，P。和Job，D。（2011）。通过白僵菌（Beauveria bassiana）保护金属制品并形成金属草酸盐复合物。 Front Microbiol 2：270。
Joseph，E.，Letardi，P.，Comensoli，L.，Simon，A.，Junier P.，Job，D。和Wörle，M。（2013）。评估保护生物方法铜合金人工制品。在：Hyslpop，E.，Gonzalez，V.，Troalen，L。和Wilson，L。（编辑）。 2013年金属会议论文集，ICOM-CC金属工作组临时会议。历史悠久的苏格兰，爱丁堡，203-208。
Joseph，E.，Simon，A.，Mazzeo。 R.，约伯。 Daniel和Wörle，M。（2012）。对腐蚀金属制品进行创新生物处理的光谱表征。拉曼光谱在艺术和考古学中 43（11）：1612-1616。
Kooli，W.M.，Comensoli，L.，Maillard，J.，Albini，M.，Gelb，A.，Junier，P。和Joseph，E。（2018）。用于稳定腐蚀铁物体的细菌铁还原和生物矿物质形成。 Sci Rep 8（1）：764。
Meissner，K.，T。Lippert，A。Wokaun和D. Guenther（2004）。激光诱导击穿光谱与LA-ICP-的比较分析痕量金属MS。 Thin Solid Films 453：316-322。
Monnier，J.，L。Bellot-Gurlet，D。Baron，D。Neff，I。Guillot和P. Dillmann。（2011年）。拉曼结构定量成像方法及其在铁室内大气腐蚀产品中的应用。 J拉曼光谱 42（4）：773-781。
Ranalli，G.，Alfano，G.，Belli，C.，Lustrato，G.，Colombini，MP，Bonaduce，I.，Zanardini，E.，Abbruscato，P.，Cappitelli，F。和Sorlini，C。（2005 ）。应用于文化遗产的生物技术：使用活菌细菌和酶对壁画进行生物修复。 J Appl Microbiol 98（1）：73-83。
Rémazeilles，C.，K。Tran，E。Guilminot，E。Conforto和P. Refait。（2013年）。淹水考古木材中Fe（II）硫化物的研究。 Stud Conserv 58（4）：297-307。
Rimmer，M.，Watkinson，D。和Wang，Q。（2012）。使用脱氧碱性溶液从考古铁制品中提取氯化物的效率。 Stud Conserv 57（1）：29-41
Schwertmann，U。和Cornell，R。M.（2008）。实验室中的氧化铁：准备和表征。 John Wiley＆amp;儿子。
Scott，D.A。和Eggert，G。（2009）。艺术中的钢铁：腐蚀，着色剂，保护。 Archetype Publications 。
Stookey，L。L.（1970）。 Ferrozine - 一种新的铁分光光度计。 Anal Chem 42（7）：779-781。
Thomas，R。（2013）。 ICP-MS实用指南：初学者教程。 CRC出版社。
Whittaker，P.，Seifried，H.E.，San，R.H.，Clarke，J.J。和Dunkel，V.C。（2001）。 L5178Y小鼠淋巴瘤细胞中铁螯合剂的遗传毒性。 Environ Mol诱变剂 38（4）：347-356。