材料和试剂

μ-Columns（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-701）
微量离心管（FroggaBio，目录号：LMCT1.7B，或同等产品）
巴斯德吸管（Fisher Scientific，目录号：13-678-20A，或同等产品）
PVDF膜（Bio-Rad Laboratories，目录号：1620177）
血清移液管，10 ml（Corning，目录号：4488，或同等学历）
Luer-Lok无菌20 ml注射器（BD，目录号：302830，或同等产品）
无菌450 nm Luer-Lok注射器过滤器（颇尔，目录号：4614，或等效物）
无菌50毫升锥形管（FroggaBio，目录号：TB50-500，或等效物）
无菌移液器吸头（Diamed，DIATEC，目录号：DIATEC520-5376，DIATEC520-5876，DIATEC520-6501或同等产品）
HEK 293T电池（ATCC，目录号：CRL-3216）
R187杂交瘤（ATCC，目录号：CRL-1912）
μMACSGFP分离试剂盒（Miltenyi Biotec，目录号：130-091-125）
10厘米培养皿（康宁，目录号：430167，或等效物）
220 nm Steritop过滤器（Merck，目录号：SCGPT10RE，或同等产品）
抗eGFP（Takara Bio，Clontech，目录号：632381）
抗Flag，HRP共轭（Sigma-Aldrich，目录号：A8592-1MG）
抗小鼠IgG，HRP共轭（Cell Signaling Technology，目录号：7076S）
抗兔IgG，HRP结合（Abcam，目录号：ab6721）
抗大鼠IgG，HRP结合（Sigma-Aldrich，目录号：AP183P）
Anti-V5（默克，产品目录号：AB3792）
Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）高葡萄糖，含L-谷氨酰胺，丙酮酸钠和酚红（WISENT，目录号：319-005-CL，或等效物）
Dynabeads M270-epoxy（赛默飞世尔科技，目录号：14321D）
ECL Substrates，即：
Clarity Western ECL Substrate（Bio-Rad Laboratories，目录号：1705060S，或同等产品）
ClarityMax Western ECL Substrate（Bio-Rad Laboratories，目录号：1705062S，或同等产品）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12483020，或等同物）
甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP381-5）
HCl（36.5-38％）（Fisher Scientific，目录号：A144S-500）
Hybridoma-SFM（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：12045076）
KCl（Fisher Scientific，目录号：BP366-500）＆nbsp;
KH 2 PO 4 （Fisher Scientific，目录号：P285-500）
甲醇（VWR，目录号：56902-543）
Milli-Q水
Na 2 HPO 4 （Fisher Scientific，目录号：S393-3）
NaCl（Fisher Scientific，目录号：BP358-10）
NaOH，10N认证（Fisher Scientific，目录号：SS255-1）
NuPAGE TM 4-12％Bis-Tris凝胶（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：NP0335BOX）
NuPAGE TM MOPS SDS运行缓冲液（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：NP0001）
青霉素 - 链霉素（GE Healthcare，目录号：SV30010，或同等学历）
聚乙烯亚胺（PEI）（Polysciences，目录号：23966-1，或同等学历）
蔗糖（WISENT，目录号：800-081-LG，或同等学历）
Tris Base（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
Tween TM 20（Fisher Scientific，目录号：BP337-100）
PBS（10x）（见食谱）
PBS中20％蔗糖（参见食谱）
完整的DMEM（见食谱）
Tris-Glycine转移缓冲液（25x）（见食谱）

注意：我们使用VWR作为颇尔和康宁产品的分销商。

设备

μMACS分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-602）
4°C冰箱
平衡（Fisher Scientific，目录号：01-919-358，或等效物）
制造商：OHAUS，目录号：30100606 / RM。
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，目录号：1323TS，或同等产品）
Digital Imager（GE Healthcare，型号：ImageQuant LAS 4000，目录号：28955810，或同等产品）
血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：3100，或同等学历）
MACS MultiStand（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-303）
磁力架（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
显微镜（Fisher Scientific，目录号：LMI6PH2，或等效物）
制造商：Laxco，目录号：LMI6PH2。＆nbsp;
移液器（Gilson，目录号：F167700，或等效物）
冷藏台式离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM ST 40，目录号：75004524，或同等产品）
摇摆平台（Maxi Rotator）（Labline仪器，型号：4631型或同等产品）
组织培养箱，湿度，温度和CO 2 调节（Thermo Fisher Scientific，目录号：3110，或等效物）
Tube Revolver（Thermo Fisher Scientific，目录号：88881002或同等产品）
70Ti型转子（Beckman Coulter，目录号：337922，或同等产品）
70Ti型管（聚碳酸酯管和盖子）（Beckman Coulter，目录号：355618，或同等产品）
超速离心机（Beckman Coulter，目录号：969347，或同等产品）

程序

在8ml完全DMEM中用3×10 6个 293T细胞接种10cm培养皿。对于该测定，我们通常每种条件使用至少2个培养皿。
让细胞在37℃，5％CO 2 下生长，直至达到70-80％汇合，这应该需要大约24小时。
转染感兴趣的病毒质粒。对于M-MLV，我们通常使用10μg质粒DNA，但可以根据病毒进行优化（注1）。
将细胞放回培养箱中进行病毒生产72小时（注2）。
在收集病毒上清液之前，将超速离心机预冷至4°C。
使用血清移液管收集病毒上清液（约15ml），并将其转移到50ml锥形管中。
将该上清液在500 x g 下离心5分钟以清除细胞碎片。
在该离心步骤期间，准备适当数量的注射器和450nm过滤器。
将澄清的上清液转移到注射器中，并将其直接过滤到70Ti型管中。
用培养基或PBS填充每个管，使其含有低于最大阈值约5.5ml。
将无菌巴斯德吸管放入每个70Ti管中，将薄侧浸入病毒培养基中。参见图2。
通过巴斯德吸管缓慢加入无菌20％蔗糖溶液，使其在病毒上清液下方形成缓冲层。 5毫升这种溶液就足够了（注3）。参见图2。
适当平衡每个管以进行超速离心。无菌培养基或PBS可用于调节病毒样品的质量。
盖上每根管子，确保O形圈和铝盖正确密封。将这些管子适当地插入70Ti型转子中，然后将转子插入超速离心机（注3）。
超速离心这些样品，加速和减速设定为50％，在4°C，100,000 x g 3小时（注4）。
从转子上取下管子，观察颗粒并用标记圈住。随着离心后的时间过去，这些变得更难以看到，因此您需要尽快进行。参见图2.

图2.通过超速离心的病毒浓度。巴斯德吸管（A）用于添加不同的蔗糖底层（B）。超速离心后，将沉淀物显现并用标记物（C）鉴定。
用血清移液管轻轻取出上清液，将沉淀重悬于1 ml PBS中（注4）。
将该浓缩的病毒样品与过量的抗体偶联的珠子（我们使用30μl）一起孵育，靶向表面抗原（即，抗-GFP），在4℃下持续温和旋转3小时。
使用μMAC系统（注5），准备好MultiStand上的μ列。
在添加样品之前添加PBS以填充色谱柱（注释6）。
将病毒样品加载到μ柱中，让PBS通过重力流过柱子。可以收集来自该阶段的流量以用富集部分进行分析。参见图3。
用5倍体积的无菌PBS（每1ml病毒5ml）洗涤柱子。
根据需要从色谱柱中洗脱。 Miltenyi描述了洗脱的多种条件，包括变性和非变性。在我们的案例中，我们希望减少非特异性洗脱并保持病毒的完整性。为此，从磁力架上取下色谱柱，将其插入微量离心管中，向色谱柱中加入250μl无菌PBS，将其收集在试管中。洗脱液也含有磁珠，因此它将是半透明的棕色，如图3所示。
样品可以在4°C下短期（<1天）储存，并在-80°C下长期储存（数周）。

图3.完整病毒的μMACS分离和温和洗脱。将μ-柱牢固地装入磁力架上的分离器中，并且可以在下方放置微量离心管以收集流过（A）的流量。从磁场（B）中除去μ-柱将使磁珠在任何所需的洗脱缓冲液中移动。珠子也将从柱子中洗脱，使洗脱液呈半透明的棕色（C）。

数据分析

SDS-PAGE分析：样品纯度可通过定量整合病毒组分来确定。建议使用蛋白质组学技术，如SDS-PAGE或ELISA，因为这是基于蛋白质相互作用的分离。然而，病毒基因组定量是评估总病毒分离效率的合适替代方案。在我们的研究中，M-MLV被探测p30衣壳蛋白（R187，大鼠单克隆，1μg/ ml），病毒包膜糖蛋白Env-eGFP（抗eGFP，JL-8，小鼠单克隆，0.2μg/ ml）和重组gPr80（gPr93FV含有N-近端Flag-标签和C-末端V5-标签，将其观察到的大小从80kDa转移至93kDa;抗-V5，兔多克隆，0.2μg/ ml）。对于p30衣壳抗体，根据ATCC使用Hybridoma-SFM概述的条件培养R187细胞。上清液可以直接使用或使用蛋白A或G树脂纯化。所有其他抗体均购自材料和试剂部分中指出的供应商。
＆NBSP;为了获得最佳分辨率，我们在MOPS运行缓冲液中使用NuPAGE 4％至12％梯度凝胶在200 V下保持约45-55分钟。使用Tris-甘氨酸转移缓冲液在100V下对PVDF膜进行转移约80分钟。使用PBS-T中的5％牛奶在室温下封闭1小时。阻塞，洗涤和抗体染色步骤最好在摇摆平台上进行。我们通过在封闭缓冲液中在4°C下进行一级抗体染色来获得最佳结果，而二级抗体（与HRP缀合）可以在封闭缓冲液中以适当的稀释度在室温下孵育1小时（抗小鼠IgG二级1： 5,000;抗兔IgG继发0.1μg/ ml;抗大鼠IgG二次，0.05μg/ ml）。使用适当强度的ECL（即，Bio-Rad，Clarity，1705060S或ClarityMax，1705062S或等同物）进行检测，并在数字成像仪（GE LifeSciences，ImageQuant LAS 4000或等效物）上进行分析。）。优良作法是使用靶向病毒组分的多种抗体分析未处理的样品（输入），流过（未结合）和洗脱（IP）免疫沉淀，作为监测IVIP测定性能的方式。
结果解释：这里描述的IVIP方案被开发用于表征逆转录病毒整合膜蛋白质糖蛋白（gPr80）与完整EV和病毒的差异关联，以及确定其在M表面的膜结构。 -MLV病毒粒子。为了帮助表征gPr80与病毒粒子和EV的关联，我们开发了gPr93FV，一种含有N-近端Flag和C-末端V5表位标签的重组gPr80构建体。这些特征使我们能够通过与针对每个表位标签的抗体相互作用的方式确定EV和M-MLV的外包膜中gPr93FV的方向。鉴于我们之前已经证明病毒包膜糖蛋白，Env（或更具体地，Env-eGFP）是在M-MLV表面上大量发现的选择标记，并且很少在EV上检测到（Tang et al。＆NBSP;使用靶向病毒蛋白的三种抗体探测输入，未结合和IP级分。图4A显示衣壳（p30）存在于未结合中，但如预期的那样富集IP部分。 Env-eGFP（捕获抗原）存在于IP部分中但不存在于未结合部分中，表明成功且纯的完整病毒制剂（图4B）。使用V5抗体，在未结合和IP部分中检测到gPr93FV（图4C）。这些数据以及我们研究中的其他实验使我们得出结论，gPr80可作为N exo C cyto中的I型整合膜蛋白插入M-MLV包膜中

图4.通过SDS-PAGE评估IVIP样品的纯度和病毒成分。该图已经改编自Renner 等人（2018）。 M-MLV与糖基化的Gag表达质粒（gPr93FV）共同产生，并根据上述IVIP方案分离。 A）病毒衣壳（p30），B）病毒包膜糖蛋白（eGFP）和C）gPr93FV（V5）均使用NuPAGE凝胶通过SDS-PAGE显现。 gPr93FV的条带模式指示其多种糖基化状态。使用的V5抗体显示约65kDa的非特异性条带，但它不是病毒组分，因为它在IP过程中被洗掉。

笔记

从表达质粒产生病毒的转染试剂或方法可以变化。我们使用聚乙烯亚胺（PEI），该方案在Longo 等人（2013）中有详细描述。
最佳生产时间可能因病毒或细胞类型而异。
当用这些管操纵时要非常小心，因为蔗糖层可以与病毒上清液混合。重要的是这些层保持清晰和分离。
使用超速离心M-MLV浓度的标准方法进行步骤9-17。通过蔗糖垫旋转病毒除去小细胞碎片，细胞溶质材料和杂质，并且通常产生> 1。输入病毒感染率恢复90％。通过超速离心产生的颗粒预计在管底部是小的，粘稠的，略带红色的积聚物（如果在具有酚红的DMEM中产生）。对于其他类型的病毒，其他浓度方法可能更合适，更温和（Rayaprolu et al。，2018）。＆nbsp;
μMACS系统是许多中的一种选择，其还允许任何抗体的蛋白G缀合。我们还将Dynabeads M270-epoxy（Thermo Fisher Scientific）与相关的磁力架（Thermo Fisher Scientific）结合使用，该磁力架允许使用任何抗体，其中珠子的抗体脱落最少。然而，强烈推荐磁珠，因为我们发现与琼脂糖凝胶或琼脂糖珠相比，这些磁珠通常产生降低水平的非特异性结合。
如果在用PBS制备色谱柱时没有开始重力流动，可以使用含有洗涤剂的缓冲液（即，PBS + 0.1％吐温 TM 20）来填充色谱柱。一定要用较大量的无去污剂缓冲液（即，PBS）去除所有缓冲液的痕迹，因为去污剂可能会影响包膜病毒/囊泡的完整性。

食谱

PBS（10x）
NaCl 80 g / L
KCl 2 g / L
Na 2 HPO 4 7.63 g / L
KH 2 PO 4 2.4 g / L
如果要长时间储存，请通过Steritop 220 nm过滤器进行灭菌。在室温下储存
根据需要稀释1x PBS溶液
使用NaOH或HCl将pH调节至7.4并过滤灭菌
储存在4°C至25°C之间
注意：我们通常制作10倍的PBS原液，以降低与称量这些粉末相关的误差的重要性。这应该在室温下储存;冷藏可能导致盐沉淀。
PBS中的20％蔗糖（m / v）
200克蔗糖
100毫升10倍PBS溶液
用无菌H 2 O将体积调至1L 使用NaOH或HCl将pH调节至7.4
过滤消毒
存放在冰箱（4°C）
完成DMEM
DMEM高糖葡萄糖
50毫升胎牛血清
5毫升青霉素/链霉素溶液
存放在冰箱（4°C）＆nbsp;
Tris-甘氨酸转移缓冲液（25x）
72.8克Tris-Base
360克甘氨酸
用无菌H 2 O将体积调至2L 在室温下储存
在使用前，用20％总体积的甲醇稀释至1倍，剩余的无菌H 2 O（即，1 L总体积= 200 ml甲醇，40 ml 25x转移缓冲液和760ml无菌H 2 O）。

致谢

M.-A.L.拥有加拿大分子病毒学和内在免疫研究主席。这项研究得到了加拿大卫生研究院的资助（拨款89774）和安大略省研究与创新部颁发给M.-A.L的早期研究员奖。 T.M.R.持有安大略省QEII研究生奖学金。该方案在Journal of Virology（Renner et al。，2018）中开发并简要描述。我们感谢Vera A. Tang提供的有益讨论和技术支持，尤其是纳米级流式细胞仪。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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