材料和试剂

移液器吸头0.1-10μl（Eppendorf，epT.I.P.S。® Reloads，目录号：022491504）
移液器吸头0.5-20μl（Eppendorf，epT.I.P.S。® Reloads，目录号：022491521）
移液器吸头2-200μl（Eppendorf，epT.I.P.S。® Reloads，目录号：022491539）
移液器吸头50-1,000μl（Eppendorf，epT.I.P.S。® Reloads，目录号：022491555）
15毫升猎鹰管（康宁，目录号：352096）
Tygon 3350硅胶管（Saint-Gobain高性能塑料，产品目录号：ABW00002）
Safety-Multifly-Needle 21G（SARSTEDT，目录号：85.1638.935）
膜适配器（SARSTEDT，目录号：14.1112）
5 ml注射器（BD，Discardit II TM ，目录号：301285）
50毫升注射器（BD，灌注，目录号：300136）
无底6通道粘性载玻片（IBIDI，粘性载玻片VI 0.4 ，目录号：80608）
玻璃盖玻片24 mm x 24 mm（肖特，NEXTERION ®，编号1.5，目录号：D263T）
Cuvette（Eppendorf，目录号：952010069）
人体血液（取自年龄在25-40岁的男性和女性健康捐献者）
质粒ptdTomato（Takara Bio，目录号：632531）
电子。大肠杆菌菌株（DH12S，Invitrogen）
电子。用质粒ptdTomato转化大肠杆菌。 TdTomato在 lac 操纵子中编码，并且在异丙基硫代-β-半乳糖苷（IPTG）存在下诱导转录（IPTG与 lac 阻遏物结合并释放 lac来自 lac 运算符的阻遏者。质粒携带氨苄青霉素抗性的bla基因。
注意：大肠杆菌原种在含有7％二甲基亚砜（v / v）的LB中制备，并保持在-80°C。
蒸馏水（ddH 2 O）（Millipore）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D2438）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
重组人白蛋白（rHSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A9731）
注意：将rHSA溶解于ddH 2 O至8％（w / v）溶液中，并将等分试样保存在-20°C。
前列腺素I 2 钠盐（PGI 2 ）（艾博士，目录号：ab120912）
注意：将其溶于DMSO中至10 mg / ml，并将等分试样保存在-20°C。
HEPES解决方案（Sigma-Aldrich，目录号：H0887）
20％HNO 3 （Carl Roth，目录号：4337.2）
六甲基二硅氮烷（HMDS）（Sigma-Aldrich，目录号：440191）
来自人血浆的纤维蛋白原（Sigma-Aldrich，目录号：F3879）
注意：将其溶于0.9％NaCl至2 mg / ml，并将等分试样储存在-20°C。
来自人血浆的纤维蛋白原，Alexa Fluor 488结合物（Thermo Fisher Scientific，Life technology，目录号：F13191）
注意：将其溶于0.1 M NaHCO 3 （pH 8.3）至1.5 mg / ml，并将等分试样储存在-20°C。
U46619（Enzo Life Sciences，目录号：BML-PG023-0001）
注意：将其溶解在DMSO中至28.8 mM并将等分试样储存在-20°C。
腺苷5'-二磷酸钠盐（ADP）（Sigma-Aldrich，目录号：A2754）
注意：将其溶于PBS至20 mM，并将等分试样保存在-20°C。
来自牛血浆的凝血酶（Sigma-Aldrich，目录号：T4648）
注意：将其溶于0.1％（w / v）牛血清白蛋白（BSA）至100 U / ml，并将等分试样保存在-20°C。
LB肉汤（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
注意：将20g LB粉末溶于1L ddH 2 O中并高压灭菌。
异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Sigma-Aldrich，目录号：I6758）
注意：将ddH 2 O中的IPTG溶解至100 mM，并将等分试样保存在-20°C。
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
注意：将氨苄青霉素溶于ddH 2 O至50 mg / ml，并将等分试样保存在-20°C。
柠檬酸三钠脱水（C 6 H 5 Na 3 O 7 •2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S4641）
柠檬酸一水合物（C 6 H 8 O 7 •H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C1909）
葡萄糖（Merck，Calbiochem，目录号：346351）
氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：3957.3）
碳酸氢钠（NaHCO 3 ）（默克，目录号：106329）
氯化钾（KCl）（Carl Roth，目录号：6781.3）
氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：C8106）
注意：CaCl 2 •2H 2 O溶解在ddH 2 O中以制备100 mM储备溶液并在4°C下储存
酸性柠檬酸 - 葡萄糖（ACD）缓冲液，pH 4.7（见食谱）
修改了Tyrode的缓冲区（参见食谱）
纤维蛋白缓冲液（见食谱）

设备

移液管0.1-2.5μl（例如，Eppendorf，Research plus：O18485E）
移取0.5-10μl（例如，Eppendorf，Research plus：O30964E）
移液器10-100μl（例如，Eppendorf，Research plus：O30379E）
移液管100-1,000μl（例如，Eppendorf，Research plus：O29260E）
Orbi-Shaker（例如，Benchmark）
pH计（例如，Mettler Toledo）
BioPhotometer（例如，Eppendorf，型号：BioPhotometer 6131）
本生灯（例如，Campingaz）
离心机（例如，Eppendorf，型号：5804）
细胞培养培养箱（例如，Binder）
血液学计数器（例如，Horiba Medical）
KLM旋涂机（例如，Schaefer）
倒置相位对比和荧光显微镜（例如，OLYMPUS，型号：IX83）
注射泵（例如，KD Scientific，型号：KDS 100）

软件

连接到显微镜的活细胞成像软件（例如，CellSense）
斐济软件[国立卫生研究院（NIH）]

程序

洗涤血小板的分离
1. 在志愿者身上用安全的多蝇针从人体静脉取人血。丢弃前1 ml，然后再将另外5 ml放入带有714μlACD缓冲液的注射器中（参见配方1）。
  注意：＆nbsp;
  1. 志愿者在过去两周内不应服用任何影响血小板的药物。
  2. 平稳地抽血以避免血小板活化。
2. 将血液与等体积的改良Tyrode缓冲液（pH6.5）（见配方2）在15ml falcon管中混合。
3. 将步骤A2中的混合物在70℃下离心35分钟，在室温（RT）下不制动，以获得从上层回收的富含血小板的血浆（PRP）。
4. 在0.1ml rHSA（w / v）和100ng / mg PGI 2 存在下，在15ml Falcon管中，将3ml PRP与7ml改良的Tyrode缓冲液（pH6.5）混合。
5. 将步骤A4中稀释的PRP在1,200 x g 离心10分钟，在室温下离心。
6. 弃去上清液，将沉淀物小心悬浮于pH6.5的1ml Tyrode缓冲液中。
7. 在自动血液学计数器上测量血小板浓度。
8. 将纯化的血小板保存在室温下直至使用。
  注意：
  1. 血小板不能培养，因此应每天从新鲜抽取的血液中制备。
  2. 血小板制备的整个过程应该足够温和，以防止血小板活化。
细菌制剂
1. 接种 E.来自含有100μg/ ml氨苄青霉素的LB-肉汤培养基中的冷冻原种的大肠杆菌。
  注意：在本生灯上进行大肠杆菌接种。
2. 培养接种的 E.大肠杆菌在37℃，260rpm振荡过夜。
3. 第二天，稀释 E的饱和培养物。在含有1mM IPTG和100μg/ ml氨苄青霉素（1：500，体积为5ml）的LB-肉汤培养基中的大肠杆菌。
4. 培养稀释的 E.步骤B3中的大肠杆菌在37℃，260rpm下2.5小时，以允许生长至对数中期。＆nbsp;
5. 确定培养的 E的菌落形成单位（CFU）/ ml。 OD 600nm = 1时的大肠杆菌（1，通过在不同时间点接种细菌和计数菌落形成单位，确定细菌的活力作为OD 600nm 的函数增加OD 600nm .2，根据获得的生长曲线确定OD 600nm = 1时的CFUs / ml，我们得到2.8×10 8 CFU / OD 600nm = 1.0）时的ml。
6. 测量 E.通过光学密度在OD 600nm （预期OD 600nm ~0.5-0.6）下的大肠杆菌浓度。
7. 调整培养的 E.在LB培养基（0.7×10 8 CFU / ml; 1ml）中，大肠杆菌OD 600nm 等于0.25，在1,200 xg下离心 5分钟并弃去上清液。
8. 将细菌沉淀悬浮在等体积的PBS（1 ml）中，并在光照下保存在冰上直至使用。
  注意：根据实验室的安全规定进行细菌制备。
盖玻片涂层
1. 将玻璃盖玻片浸入20％HNO 3 中，在振荡器上以速度设定为60rpm振荡1小时，然后用ddH 2 O洗涤四次。
2. 在同一振荡器上将ddH 2 O中的酸洗盖玻片浸泡另外1小时，并再次用ddH 2 O漂洗两次。
3. 用KLM旋涂机将新鲜清洁的盖玻片以90转/分钟干燥10秒钟。
4. 使用旋转涂布机将HMDS以80rpm硅烷风化盖玻片30秒，以确保均匀的硅烷化。
  注意：HMDS易挥发且易燃，因此将HMDS涂在通风罩上。
5. 将6通道无底Ibidi粘滑片切成单通道载玻片（图1），然后安装到硅烷化盖玻片上。
注意：在有一定压力的情况下安装盖玻片和粘滑，直到底部密封，否则通道中的缓冲液会泄漏出来。

图1. Ibidi粘性载玻片的照片。鞋面是6通道滑块;较低的是6切割单张幻灯片。
＆NBSP;
1. 种子120μl制备 E.在PBS中，在Ibidi通道中的硅烷化盖玻片上，在37℃下30分钟的大肠杆菌（8.4×10 6 CFU）。
2. 在 E上涂上120μl纤维蛋白（参见配方4）。大肠杆菌种子盖玻片在室温下保持15分钟。
3. 用改良的Tyrode缓冲液（pH 7.4;120μl）清洗纤维蛋白包被的载玻片5次（图2和3）。
  
  图2.实验设置图。单个Ibidi粘性滑动通道安装在硅烷化玻璃盖玻片上。如红色箭头所示，移液缓冲液。
  
  图3.涂有纤维蛋白和细菌的代表性盖玻片。用 E种植新鲜清洁和硅烷化的玻璃盖玻片。将大肠杆菌在37℃下孵育30分钟，然后在室温下用纤维蛋白包被15分钟，最后用Tyrode缓冲液洗涤。 A.涂覆通道的相差图像。 B.通道的荧光纤维蛋白涂层。 C.荧光 E.大肠杆菌绑定到通道。 D.合并渠道。比例尺=10μm。
移植血小板和细菌捕获的显微镜观察
1. 使用10 4 /μl人血小板，1,000μg/ ml rHSA，200μMCaCl 2 ，2μMU46619补充修饰的Tyrode缓冲液pH 7.4，总体积240μl加入4μMADP并加入上述制备的涂有纤维蛋白和活的E的通道中。大肠杆菌。
  注意：ADP，U46619和CaCl 2 协同触发血小板活化和扩散。白蛋白是一种抗粘着蛋白，可降低基质粘附性。
2. 将步骤D1中的通道在37°C孵育1小时20分钟（图4）。
  
  图4.迁移血小板收集纤维蛋白结合的 E的代表性图像。大肠杆菌。纤维蛋白和活 E.在1,000μg/ ml rHSA，200μMCaCl 2 ，2μMU46619和4的存在下，将大肠杆菌包被的通道与10 4 /μl人血小板一起温育。 μMADP在改良的Tyrode缓冲液中于37°C保持1小时20分钟。图像显示相差（A）和表面荧光显微照片（B和C）。纤维蛋白图像（B）中的黑色区域表示通过迁移血小板清除的区域。比例尺=10μm。电子。血小板上累积的大肠杆菌和血小板迁移区域的细菌密度降低（D）。
3. 使用连接到注射泵的流体管组装Ibidi通道，并将其放置在带有加热台的倒置显微镜上。
  注意：灌注前务必小心排除注射器和试管中的气泡。
4. 使用预热（37°C）改良的Tyrode缓冲液（pH 7.4）以0.5达因/厘米 2 灌注通道1分钟以去除非粘附细菌并获取相差和表面荧光图像。
  注意：注射泵的流量Φ（ml / min）由Ibidi粘边指令提供的下列公式计算：
  
  τ=ηx97.1xΦ
  τ：剪应力（达因/厘米 2 ）
  η：动态粘度（dyn s / cm 2 ）
  
  37℃下细胞培养基的动态粘度为~0.007。
5. 用改良的Tyrode缓冲液（pH 7.4）在37℃，5达因/厘米 2 灌注通道5分钟并拍摄图像（图5）。
6. 图像采集：滤光片（激发/发射）：纤维蛋白（Alexa 488）（494 / 528nm）; 电子。大肠杆菌（tdTomato）（590/617 nm）。
  注意：根据安全规定，妥善处理含有细菌的灌注缓冲液的浪费。
  
  图5. 0.5 dyne / cm 2 和5 dyne / cm 2 后，没有血小板和血小板捕获的细菌的代表性图像。显微照片显示合并的相衬和荧光图像。比例尺=5μm。
  注意：在没有血小板的情况下，灌注后纤维蛋白（绿色）上的大肠杆菌（洋红色）数量减少。白色箭头表示被冲走的大肠杆菌。相反，通过迁移血小板收集的细菌束抵抗剪切应力。

数据分析

在FIJI软件中打开获取的图像（Schindelin et al。，2012）。
分别调整每个通道的亮度和对比度，以分别清楚地识别细菌和纤维蛋白纤维。
在灌注之前和之后手动计数纤维蛋白结合的细菌聚集体（存在和不存在血小板）。
通过将灌注后细菌聚集体的数量除以灌注前的细菌数量来计算每个实验对抗灌注的细菌的分数。例如，图6中的条形图显示了存在和不存在血小板时细菌聚集体的流动阻力。＆nbsp;
测试结果的统计显着性。在图6所示的示例中，我们重复实验6次并执行Wilcox秩和检验以测试统计显着性（R软件[R Development Core Team 2011]）。

图6.条形图显示灌注后表面结合的细菌聚集体（5 dyne /cm²）作为初始结合细菌的分数（％）。与血小板结合的细菌聚集体比细菌更能抵抗剪切应力仅与纤维蛋白结合的聚集体。 n = 6;平均值±SEM;使用Wilcox秩和检验测试统计显着性。

笔记

电子。本方案中使用的大肠杆菌（DH 12） - 菌株需要安全等级1（S1）的实验室。

食谱

ACD缓冲液，pH 4.7
85 mM柠檬酸钠三元脱水
65mM柠檬酸一水合物
111mM葡萄糖
修改了Tyrode的缓冲区
136.9 mM NaCl
12.1 mM NaHCO 3
2.6 mM KCl
5.5 mM葡萄糖
10 mM HEPES
注意：准备10x Tyrode缓冲液（1.37 mol NaCl，121 mM NaHCO 3 ，26 mM KCl）并在4°C下储存。用ddH 2 O稀释Tyrode的缓冲液，并添加葡萄糖和HEPES缓冲液以供日常使用。然后将pH调节至6.5以进行血小板分离，将7.4调节至血小板迁移。
纤维蛋白缓冲液
修饰的Tyrode缓冲液（pH 7.4）补充有300μg/ ml纤维蛋白原（1:10与Alexa488缀合物纤维蛋白原混合），12mg / ml rHSA，2U / ml凝血酶和1mM CaCl 2
注意：在使用前准备好纤维蛋白缓冲液。

致谢

该方案改编自先前发表的研究（Gaertner 等人，，2017）。我们感谢Michael Lorenz对细菌培养的出色帮助。这项工作由DFG SFB 914（SM [B02和Z01]），DFG SFB 1123（SM [B06]），DFG FOR 2033（SM和FG），德国心血管研究中心（DZHK）（MHA）资助1.4VD [SM]），FP7程序（项目260309，PRESTIGE [SM]），FöFoLe项目947（FG），Friedrich-Baur-Stiftung项目41/16（FG），Marie Sklodowska居里个人奖学金（欧盟项目747687， LamelliaActin [FG]）。

利益争夺

作者声明在本文的发表中没有利益冲突或竞争利益。

参考

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