材料和试剂

RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN，目录号：74903）
OligodT Dynabeads（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：610-02）
。SeaKem LE Agrose（Lonza，目录号：50004）
Illumina sRNA-seq 3'衔接头（Illumina，目录号：1000596）
无RNA酶水（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10977-023）
RNeasy Micro Kit（QIAGEN，目录号：74004）
南极磷酸酶（New England Biolabs，目录号：M0289S）
RNase OUT（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10777-019）
T4 RNA连接酶1（New England Biolabs，目录号：M0204S）
Illumina sRNA-seq RT引物（Illumina，目录号：1000597）
Illumina sRNA-seq 5'衔接头（Illumina，目录号：1000595）
Illumina sRNA-seq PCR引物（Illumina，目录号：1000591,1000592）
凝胶纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
dNTP（New England Biolabs，目录号：N0447S）
SuperScript II RT（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：18064-022）
Zero Blunt PCR Cloning Kit（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：K2700-40）
琼脂凝胶（Lonza）

设备

PCR热循环仪
Illumina GA II测序系统
移液管（20μl，200μl，1000μl）
磁棒

程序

使用RNeasy Plant Mini Kit根据制造商的方案（根据制造商的方案，从100mg烟草叶组织获得约60μg高分子量RNA）从植物组织中分离高分子量RNA（长度> 200bp）。
使用OligodT Dynabeads根据制造商的方案从10μg总RNA中纯化polyA RNA，并在15μl无RNA酶的水（在该步骤中使用热循环仪和磁棒）中洗脱polyA RNA。

Ligate sRNA 5'衔接子：

纯化的mRNA	14μl
sRNA 5'衔接子（10μM）	2μl（Illumina sRNA-seq 5'衔接子）
10x T4 RNA连接酶缓冲液	2μl（*如果不包括ATP，最后加入ATP至1mM）
T4 RNA连接酶I（10U /μl）	1.5μl
RNase OUT（40 U /μl）	0.5μl

20℃，6小时

Dynabeads纯化，并根据制造商的方案在15μl无RNA酶的水中洗脱
RNA断裂

分段缓冲区
1.6μl（100mM ZnCl 2，100mM Tris-HCl，pH7.0）

连接mRNA
14.4μl

70℃2.5分钟
使用RNeasy Micro Kit纯化片段化的RNA，纯化后在17μl无RNA酶的水中洗脱RNA
磷酸酶处理以除去由于断裂产生的3'磷酸酯：

碎片的RNA
16μl

10x磷酸酶缓冲液
2微升

南极磷酸酶
1微升

RNase OUT（40 U /μl）
1微升

37℃，30分钟
4°C保持
通过RNeasy Micro Kit纯化RNA，并在15μl无RNA酶的水中洗脱

Ligate sRNA 3'衔接子

来自步骤6的纯化的RNA	14.5微升
10x RNA连接酶缓冲液	2μl（*如果不包括ATP，则添加ATP至1mM最终）
RNA连接酶1（10Uμl）	2微升
RNase OUT（40 U /μl）	1微升
RNA适配体3'0.5μl	（10μM，Illumina sRNA-seq 3'衔接头）

20℃，4小时

反转录
制备以下混合物，在70℃加热2分钟并置于冰上。

衔接子连接的RNA
4微升

SRA RT引物
0.5μl（Illumina sRNA-seq RT引物）

50 mM dNTP
0.5μl

制备以下混合物并加入到上述反应中：

5x第一链缓冲液
2微升

100 mM DTT
2微升

RNase OUT（40 U /μl）
0.25μl

48℃3分钟，然后加入：
SuperScript II RT 0.75μl
44℃60分钟
PCR扩增
准备以下混合物并加入RT反应：

Phusion HF 2x mix
25μl

引物GX1
1μl（Illumina sRNA-seq PCR引物）

引物GX2
1μl（Illumina sRNA-seq PCR引物）

无核酸酶水溶液
13微升

运行以下协议：
1. 98°C 30秒
2. 30-35个周期：
  98℃10秒
  60°C 30秒
  72℃15秒
3. 72℃10分钟
4. 4°C保持
通过1.5％琼脂糖凝胶运行PCR产物，切割150bp和250bp之间的拖尾区域，并通过凝胶纯化试剂盒纯化，并在25μl洗脱缓冲液中洗脱。
通过生物分析仪检测文库质量高灵敏度DNA测定法检查大小分布（在此步骤中使用1μl样品，预期生物分析物电泳图谱中约250bp的拖尾区域，参见图1） br />

图1. dRNA-seq文库的生物分析仪分析上部分是来自生物分析仪运行的电泳图，两条蓝线之间的峰区域代表纯化的dRNA构建体。下面的电泳图显示了通过生物分析仪2100软件对峰区域的分析
使用Zero Blunt ^？ PCR克隆试剂盒克隆几个克隆的文库和序列，以验证来自植物转录物的插入片段的存在。
使用在Illumina GA II测序系统上运行的小RNA测序来对文库进行测序

致谢

该协议的原理和应用在Li等人（2012）中进行了简要描述。这项工作是由国家科学基金会植物基因组研究计划赠款（DBI-0218166）和联合国支持国家农业部（CRIS 5335-22000-007-00D）。作者声明没有利益冲突。

参考文献

Li，F.，Orban，R。和Baker，B。（2012）。 SoMART：用于植物miRNA，tasiRNA和靶基因分析的网络服务器 Plant J 70（5）：891-901。
（当您在出版物中使用此方法时请引用本文）