材料和试剂

注意：以下材料也可以替代其他公司的同等试剂。细胞培养基和添加剂将根据用于测定的细胞而变化。对于我们的方案，我们使用来自新生小鼠和肥大细胞系MCP-5的原代真皮成纤维细胞。

细胞培养和计数
1. 70％乙醇
2. 重组小鼠IL-3（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：PMC0034）
  注意：冻干的mIL-3应储存在4°C。在≤-20°C下分装并储存重组的mIL-3，在重建后12个月内使用。
3. Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）（HiMedia Laboratories，目录号：AL066A）
  注意：在4°C下储存长达12个月。
4. 胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：26140095）
  注意：在-20°C下保存长达12个月。
5. 丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：11360070）
6. 非必需氨基酸（赛默飞世尔科技，Gibco TM ，目录号：11140050）
7. RPMI介质（Sigma-Aldrich，目录号：R0883）
  注意：储存在4°C。介质对光敏感，在制造后12个月内使用。
8. 青霉素 - 链霉素溶液（10,000 U / ml青霉素G钠和10,000μg/ ml硫酸链霉素，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15140122）
  注意：在制造后的12个月内使用。
9. 胰蛋白酶溶液，2.5％10x原液（HiMedia Laboratories，目录号：TCL051）
  注意：在制造后的12个月内使用。
10. 台盼蓝染色（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15250061）
  注意：在制造后3年内使用。
11. 1x PBS（参见食谱）（冷泉港，doi：10.1101 / pdb.rec556）

Collagen Lattice
1. 10μl，200μl和1,000μl移液器吸头（任何所需的制造）
2. 0.22-μm注射器驱动的过滤器单元（默克，目录号：SLGV033RS）
3. 10毫升注射器（Dispo Van）
4. 24孔细胞培养板（Eppendorf，目录号：0030722116）
5. 15毫升渐变离心管，灭菌（Tarsons，目录号：546021）
6. 1.5 ml微量离心管（Corning，Axygen ®，目录号：MCT-150-C）
  注意：使用前需要进行高压灭菌/灭菌。
7. 鼠尾胶原蛋白1型（默克，目录号：08-115）
  注意：储存在4°C，在制造后12个月内使用。
8. 冰醋酸99.8％（Sigma-Aldrich，目录号：109088）
  注意：储存在15-30°C。
9. NaOH颗粒（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
  注意：储存在15-30°C。
10. 原料胶原蛋白溶液（3毫克/毫升）（见食谱）
11. 1 M NaOH溶液（参见食谱）
12. 醋酸溶液（0.1％）（见食谱）
图像采集/分析
1. Parafilm（Bemis，目录号：PM996）
2. 结晶紫染色剂（可选; Sigma-Aldrich，目录号：C3886）
  注意：储存在15-30°C。

设备

10μl，200μl和1 ml移液器（任何所需的品牌）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R或同等产品）
血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
培养箱（CO 2 培养箱，Thermo Fisher Scientific，型号：Forma TM Steri-Cycle TM ，或等效物）
显微镜（奥林巴斯，型号：SZX16或同等产品）
数码相机320万像素（尼康，型号：COOLPIX A10或同等产品）和相机支架
平板扫描仪（爱普生，型号：V39或同等产品）

注意：任何单独列出的设备（5,6或7）都足以完成胶原凝胶的最终成像。

软件

ImageJ Software v.1.8.0（National Institutes of Health，Bethesda，MD， https：// imagej。 nih.gov/ij/download.html ）（Schindelin et al。，2012; Rueden et al。，2017）

程序

先前已经描述了胶原收缩测定以评估激动剂/抑制剂对成纤维细胞的收缩性质的影响（Ngo 等人，2006; Su和Chen，2015）。它提供了一种测量不同细胞类型的收缩特性的简便方法。下面提供了整个协议的概要（图1）。本文强调了在不同条件下用于研究异型细胞 - 细胞相互作用（Pincha et al。，2018）期间成纤维细胞介导的收缩的该试验的用途。

图1.胶原收缩测定的概要

用于制造胶原凝胶的胶原蛋白的制备
1. 醋酸溶液（0.1％）（见配方1）
2. 储备胶原蛋白溶液（3毫克/毫升）（见食谱2）
用于胶原蛋白凝胶形成的NaOH滴定
注意：不同批次的胶原蛋白通常会有胶原蛋白浓度和pH值的变化。在使用新批次的胶原蛋白来优化固化之前，有必要进行NaOH滴定。
1. 在8个1.5ml管中分装0.4ml DMEM（或选择的培养基）。
  注意：最好使用未开瓶或新制备的瓶子中的介质。由于CO 2 的损失，旧介质等分试样倾向于随时间改变pH。
2. 预先标记从4μl到8μl的24孔培养皿的8个空孔。任何带有空孔的旧24孔培养皿也可用于滴定步骤。
3. 向每个含有管（在步骤B1中制备）的培养基中加入0.2ml 3mg / ml原液胶原溶液（步骤A2中制备），并通过移液（避免形成气泡）充分混合。每管中的最终胶原浓度应为1mg / ml。注意，添加胶原溶液（具有酸性pH）将使含酚红的介质变黄。由于此阶段没有细胞，可以将胶原蛋白一次性添加到所有管中。
4. 向第一个试管中加入1μl1MNaOH，并将该溶液与1ml移液管（设定为500μl）轻轻混合几次（避免产生气泡）。
5. 立即取500μl制备的混合物并将其加入24孔培养皿的预先指定的孔中。
6. 用增加体积的1M NaOH重复步骤B4-B5。即，2-8μl。
7. 使混合物在室温下固化约20分钟。
8. 选择产生充分凝固的圆形凝胶所需的最少量NaOH，其中介质为粉红色（图2）。
  注意：选择较高的NaOH体积会导致胶原凝胶变得比理想的碱性更强，这可能不是您感兴趣细胞的最佳微环境。它还会导致凝胶具有很高的刚性，阻碍细胞介导的收缩，从而产生错误的结果。
  
  图2.用于胶原凝胶形成的NaOH滴定。用尼康A10相机拍摄的不同体积的NaOH（在1-8孔中依次加入1-8μl）制备的胶原凝胶图像。在孔7中用7μlNaOH获得充分凝固的圆形凝胶（用黑色箭头标记），并用于后续实验。
用于胶原收缩测定的凝胶的制备
以下步骤已被优化用于分析成纤维细胞在与另一种细胞类型如肥大细胞相互作用时胶原凝胶的收缩。相同的方案可用于单独使用成纤维细胞的实验。
1. 从培养皿中胰蛋白酶化粘附的成纤维细胞。取出用过的培养基，用PBS洗涤，用2ml含0.25％胰蛋白酶的PBS溶液（1x胰蛋白酶）孵育30秒-1分钟。通过加入2ml含有新鲜血清的培养基中和胰蛋白酶。将分离的细胞收集在该4ml培养基溶液中并转移至15ml锥形管中。通过在150 离心下离心4分钟沉淀细胞，然后吸出并除去培养基。对于悬浮培养物如肥大细胞，将细胞悬浮液直接转移到15ml锥形管中，并通过在100μM离心4分钟沉淀，然后吸出并除去用过的培养基。
2. 将细胞沉淀重悬于1ml用于实验的培养基中。
  注意：＆nbsp;
  1. 根据无血清的细胞类型活力，将细胞重悬于完全培养基或无血清培养基中。当细胞在无血清条件下存活时，建议使用无血清培养基。例如，与在无血清培养基中生长的成纤维细胞相比，在含有血清的培养基中生长的成纤维细胞通常表现出更高的收缩基础。然而，一些细胞类型如肥大细胞在没有血清的情况下是不可行的，因此必须在这样的实验装置中使用完整的培养基。
  2. 凝胶收缩直接依赖于血清浓度，因此当使用含有血清的培养基时，在所有孔和处理条件下使用均匀浓度。
3. 确定重悬沉淀中活细胞的数量。使用血细胞计数器和台盼蓝染料（或等效替代品）计算重悬的细胞。
  注意：维持胶原凝胶中均匀细胞数是至关重要的，必须仔细计算数量（即所用细胞悬液的体积）以获得最佳收缩。建议在分析异源相互作用的情况下，仅使用一种细胞类型或不同比例时，使用不同细胞数确定基础收缩的初步实验。
4. 每孔所需的原代成纤维细胞的数量可以是50,000孔/孔至100,000孔/孔的24孔培养皿。进行以下计算以进行技术重复。如果在实验中仅使用成纤维细胞，则在15ml锥形管中的1,200μl培养基中重悬150,000-300,000个细胞。在涉及两种不同细胞类型如成纤维细胞和肥大细胞之间相互作用的实验装置中，添加的肥大细胞数应为成纤维细胞数的三倍。该比例已根据经验确定肥大细胞和成纤维细胞之间的最佳相互作用（Pincha et al。，2018）。用于共培养的细胞悬浮液的最终体积应达到1,200μl。
  注意：建议每个实验条件的孔重复三次。在同一锥形管中为每组一式三份制备混合物，或为每个孔制备单独的混合物。
5. 用600μl3mg/ ml原料胶原溶液和预定体积的1M NaOH对3个孔（步骤B1-B8）保持移液管准备并立即将其加入带有细胞悬浮液的锥形管中。凝胶混合物中胶原蛋白的最终浓度为1毫克/毫升。＆nbsp;
6. 通过轻轻吹打快速混合溶液直至颜色为均匀的粉红色（避免产生气泡），并将500μl混合物添加到24孔培养皿的每个预先指定的孔中。丢弃任何剩余的凝胶混合物。
  注意：始终准备额外体积的混合物，因为它可确保正确混合并将所需体积转移到所有孔中，并最大限度地减少气泡形成。适当混合NaOH和胶原蛋白对于保持整个凝胶中均匀的胶原浓度和凝固是必不可少的。强力搅拌可能会使胶原纤维分离，导致凝胶凝固不良。
7. 如果为单个井准备混合物，请使用步骤C4-C5中列出的三分之一的体积。
  注意：在将所有细胞/试剂的量减少一半后，也可以使用48孔培养皿。由于凝胶收缩缺乏一致性并且难以对凝胶成像，因此不建议进一步减少体积或使用较小的孔。
8. 使凝胶在室温下固化20-30分钟。如果那时凝胶没有固化，则表明混合不当或NaOH浓度低，建议重新开始。
9. 凝胶凝固后，每孔加入500μl培养基。
10. 通过沿着凝胶边缘非常小心地移动10μl移液管尖端，将凝胶从孔壁上解离，注意不要损坏或撕裂凝胶。
  注意：确保仅在添加培养基后才将凝胶从孔中解离，因为当孔中含有培养基时，解离更容易，并防止凝胶受损。
11. 为确保凝胶与孔完全分离，轻轻旋转24孔板。
12. 对于检查因子/化合物对收缩的影响的实验，将物质以所需浓度添加到每个孔中的培养基中。建议将井作为阴性和阳性对照。对于阴性对照，添加不含任何测试化合物的培养基对于阳性对照，添加已知会导致细胞类型收缩的化合物，例如，使用TGFβ作为成纤维细胞。
  注意：建议在添加到凝胶之前将因子/化合物与培养基混合，以确保均匀分布。
13. 将板置于37℃培养箱中，在5％CO 2 加湿条件下，取出在预定时间点成像。
  注意：要确定细胞类型是否会产生非常高的基底收缩，请在3个孔中制作没有细胞的凝胶。使用这些凝胶的尺寸与细胞播种的尺寸进行比较。没有细胞的凝胶的均匀性也是正确实验设置的指标，我们建议至少在最初几次设置它。
测量胶原蛋白收缩
胶原凝胶收缩应在凝胶凝固后的不同时间点（如0小时，4小时，12小时，24小时，48小时和72小时）测量，以适合实验问题。
1. 如果从无菌条件中取出进行成像，取24孔培养皿并用封口膜包裹。
2. 将其放置在带有相机的立体显微镜上，并使用最小变焦和适当的光照设置对每个孔进行成像（图3）。作为替代方案，使用固定在适当高度的支架上的数码相机并依次对每个井进行成像，或使用平板扫描仪扫描整个盘子的图像。
  注意：对所有时间点测量使用相同的设置以获得准确的结果。使用显微镜或数码相机获得具有清晰凝胶轮廓的最佳分辨率图像。
  
  图3.肥大细胞 - 成纤维细胞共培养导致24小时胶原蛋白收缩增加。胶原凝胶图像接种：A。无细胞; B.仅成纤维细胞; C.用Olympus SZX16显微镜以0.7x放大倍数（比例尺= 1mm）拍摄具有成纤维细胞的肥大细胞。每个面板中的凝胶都用黑色线条勾勒出来。
3. 如果不是实验结束，则在成像后立即将培养皿放回培养箱中（在移除封口膜并用70％乙醇擦拭物对培养板灭菌之后）。
4. 当在最后时间点成像凝胶时，可以通过用结晶紫染色来获得更好的凝胶可视化。
  1. 用移液管非常小心地从每个孔中取出培养基。避免在此步骤中使用真空吸气器，因为它可能会损坏凝胶。
  2. 向每个孔中加入1％结晶紫溶液（水中制备）并孵育5-10分钟。
  3. 小心吸取结晶紫，再次注意不要损坏凝胶。
  4. 用PBS溶液洗涤凝胶直至除去过量的结晶紫。
  5. 取出PBS并对紫色凝胶成像（图4）。
    注意：
    1. 使用钝钳将其从孔中取出并置于平坦表面上，可以更容易地对凝胶成像。但是，如果凝胶太软，可能会破裂或变形，请避免这样做。
    2. 凝胶可以嵌入石蜡或组织冷冻培养基中进行切片，并在细胞 - 细胞相互作用的情况下分析细胞形态或定位。
    图4.肥大细胞 - 成纤维细胞共培养物导致72小时胶原蛋白收缩增加。结晶紫染色的胶原凝胶图像接种：A。无细胞; B.仅成纤维细胞; C.用尼康A10相机拍摄的具有成纤维细胞的肥大细胞。凝胶用白线勾勒出轮廓。
5. 将图像保存为.tiff文件，然后使用ImageJ（或FIJI）打开。使用这些图像计算胶原蛋白凝胶收缩。

数据分析

打开ImageJ软件，在“分析”菜单选项中，选中“设置测量”选项中“区域”选项旁边的复选框。
打开每个图像并使用徒手选择绘制凝胶的轮廓。如果是完美的圆形凝胶，也可以使用椭圆形选择。
注意：更改图像的亮度或对比度设置，以获得更清晰的凝胶轮廓，以便进行精确的面积测量。
然后对于每个凝胶，单击“分析”菜单中的“测量”（或使用快捷键Ctrl + M），在绘制轮廓后检索凝胶的表面区域。
复制所有凝胶的面积测量值，并将它们粘贴到每个时间点的Excel工作表上。
在测量结束时，取每个条件的一式三份的平均值。收缩数据可以使用平均值以两种方式表示：
1. 对于每个条件，将每个时间点的平均面积归一化为相应的0 h平均面积。然后将相应条件的面积（Y轴）与时间点（X轴）绘制在同一图表上的线上。
2. 如果仅需要终点测量，则将该时间点的所有条件的平均终点读数归一化到控制，并将值显示为Y轴上的面积和X-上的不同条件的直方图。轴。
显示倒置值（即，1 /面积）表示胶原收缩的增加。使用三次重复值计算平均值的标准误差（图5）。

图5.胶原蛋白收缩的图形表示。 A.胶原蛋白凝胶在24小时的时间间隔内在72小时内收缩。 B. 72小时时胶原凝胶收缩的倍数变化。使用单因素方差分析进行统计分析，然后进行Tukey的 post-hoc 分析。 * = P ＆lt; 0.05。

食谱

乙酸溶液（0.1％）
1. 通过向24.975毫升去离子水中加入0.025毫升100％冰醋酸制备25毫升0.1％乙酸
2. 使用0.2-μm过滤器对溶液进行过滤灭菌，并在4°C下储存
3. 该解决方案可以无限期地存储，并且如果与外部环境保持适当密封，则不需要每次都新鲜
原料胶原蛋白溶液（3毫克/毫升）
1. 在0.1％乙酸（配方1）中稀释鼠尾1型胶原，在室温下使原液浓度为3 mg / ml
2. 确保胶原蛋白均匀溶解
3. 使足够小的体积进行3-4次实验可确保胶原蛋白的均匀溶解
4. 在4°C适当密封后储存，直至使用
1M NaOH溶液
1. 将400mg称重的NaOH颗粒溶解在8ml蒸馏水中
2. 在颗粒溶解后，用蒸馏水补足体积至10ml
3. 将溶液以1ml等分试样在15-30℃下在气密塑料容器中过滤并储存。在准备3个月内使用
1x PBS（Dulbecco）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>CaCl _{2 （无水）
0.10克/升
KCl
0.20克/升
KH _{2 PO _{4
0.20克/升
MgCl _{2 •6H _{2 O
0.10克/升
NaCl
8.00克/升
NaH _{2 PO _{4 •7H _{2 O
2.16克/升
将pH调节至7.4

注意：使用CaCl 2 和MgCl 2 是可选的。}}}}}}}}

致谢

作者要感谢Jamora实验室成员对实验细节和富有洞察力的讨论进行严格审查。该方案改编自G.T Furuta和E. Song实验室公布的方法（Ngo et al。，2006; Su et al。，2015）。这项工作得到了生物技术部（印度政府）拨款号（BT / PR8738 / AGR / 36/770/2013），NIH / NIAMS（格兰特5R01AR053185-03），美国癌症协会（格兰特115457）的资助。 -RSG-08-164-01-DDC）和CJ的Hellman教师奖学金。 DBT的国家小鼠研究资源（NaMoR）资助（BT / PR5981 / MED / 31/181/2012; 2013-2016）部分支持了动物工作。结核病由科学和工业研究理事会（印度政府）奖学金支持。 RKZ得到了生物技术部（印度政府）奖学金的支持。

利益争夺

作者声明不存在利益冲突。

参考

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