材料和试剂

木片床上用品
3厘米宽x 1厘米高的铝杯
Ziploc包
地面草药和香料（Club House品牌，虽然其他都可以接受）

设备

亚克力玻璃笼（50厘米×25厘米×20厘米和50厘米×50厘米×20厘米）（图1）
摄像机

图1.适应性设备。用于程序A-D的丙烯酸玻璃保持架（50 cm x 25 cm x 20 cm）的照片。

软件

任意迷宫行为跟踪软件（Stoelting Co）
GraphPad Prism（GraphPad软件）

程序

气味准备
1. 将250毫升木屑床上用品收集到一个容器中（可以使用拉链储存袋）。
2. 发现有效的中性价气味包括肉豆蔻，香草醛，香菜，香蕉，大蒜，肉桂，百里香，杏仁，洋葱粉，咖喱，姜，咸味，小茴香，莳萝，茉莉，咖啡，牛至，鼠尾草和迷迭香。
3. 加入1汤匙的气味源，并与木屑床上用品充分混合，以确保均匀分布。
4. 盖好/密封容器直到准备好使用。
5. 重复步骤A1-A3以准备供应的每种气味。
6. 为了准备一种气味，可将1汤匙混合气味的床上用品加入小型一次性杯子或称重船中。
7. 将气味杯的底部粘上并放在测试室内。

空间气味记忆测试（图2）

图2.测试嗅觉空间记忆的范例。该测试使用两个编码阶段和一个检索阶段，每个长度为5分钟，并以15分钟的间隔间隔分开。目的是测量记住空间背景中气味发生位置的能力。正确的记忆表达将驱使老鼠调查在上下文中的新位置发现的气味（用红色表示）。
1. 准备两个50厘米×25厘米×20厘米的丙烯酸玻璃顶部开口的笼子，以代表不同的背景（背景A和B）。每个笼子可以通过在外侧粘贴不同的图案壁纸或通过使用周围的一组物体来修改以获得不同的空间线索。可以在一种情况下使用地板垫层以改善可区分性。
2. 将环境A放置在昏暗的房间内（约30 lx）的高架桌面上。
习惯：
1. 从家笼中取出鼠标并将其放在上下文A中，让它探索15分钟。
2. 将动物置于保持笼中，并将上下文A替换为上下文B.
3. 5分钟后，将动物置于环境B中再进行15分钟的探索。
编码：
1. 将动物放回保持笼中5分钟并准备上下文A，使得在笼子的两端呈现两种不同的气味（即，左边是气味1，右边是气味2）。
2. 将动物置于背景A中，让它们探索两种气味，持续5分钟。
3. 将动物放回保持笼中15分钟，并将上下文A替换为上下文B.
4. 将气味置于上下文B中相反的位置（即，右侧为气味1，左侧为气味2）。
5. 在上下文B中设置动物并允许它们在新位置探索两种气味5分钟。
检索：
1. 将动物放回保持笼中15分钟，并用上下文A替换上下文B.这次，在腔室的两侧放置两个副本的一种气味。
2. 让动物在将它们送回家笼之前探索5分钟的气味。

时间气味记忆测试（图3）

图3.测试嗅觉时间顺序记忆的范例。该测试使用三个编码阶段和一个检索阶段，每个长度为五分钟，并以15分钟的间隔间隔分开。目的是测量在时间序列中气味何时发生的记忆能力。正确的记忆表达会驱使老鼠调查之前遇到的气味（用红色表示）。重要的是，空间背景是不变的。
1. 在昏暗的房间内，使用透明的50厘米×25厘米×20厘米的丙烯酸玻璃笼升高到桌面。
习惯：
1. 将动物从其家笼中取出并将其放置在测试室内，使其探索15分钟。
编码：
1. 将动物置于保持笼中5分钟，并在测试室的相对两端设置两份气味1。
2. 将动物放回测试室中，让它们探索气味5分钟，然后将它们放回保持笼中15分钟。
3. 每次使用两组不同的气味重复步骤C4两次。
检索：
1. 设置测试室，使序列中最早出现的气味（气味1）和最近出现的气味（气味3）放在相反的两端。
2. 将动物放入试验室，让它们在将它们送回家笼之前探索两种气味。

新型气味识别测试（图4）

图4.用于测试新型气味识别的范例。该测试使用三个编码阶段和一个检索阶段，每个长度为五分钟，并以15分钟的间隔间隔分开。目的是测量检测新颖和熟悉的气味的能力。正确的记忆表达将驱使老鼠研究新的气味（用红色表示）。重要的是，此任务的性能与上下文的内存无关。
1. 遵循程序C概述的程序的步骤C1-C5。
检索：
1. 设置测试室，使序列中最早出现的气味（气味1）放在先前未开发的气味（气味4）的另一侧。
2. 将动物放入试验室，让它们在将它们放回家笼之前探索两种气味5分钟。
什么时候记忆测试（图5）

图5.用于测试集成的“何时何时”气味记忆的范例。该测试在两个编码阶段（10分钟）和一个检索阶段（5分钟）中进行，每个阶段由一个分开 - 迟到。目的是检查基于记忆的行为判断，同时动物同时权衡气味识别，时间距离和空间位置。对于集成（什么时候在哪里）内存的成功记忆将产生一种探索模式，以便优先研究具有NL / TD配置的气味，同时最少研究FL / TR配置。

习惯：
1. 使动物习惯于测试场地，其由50cm×50cm×20cm透明丙烯酸玻璃开放场组成30分钟。
编码：
1. 将动物放置在笼子中5分钟，并在场地内的两个相邻角落放置两种不同的气味。
2. 让动物探索两种气味10分钟，然后将它们放回保持笼中1小时。
3. 在相对的相邻角落处用新的一对不同的气味替换气味，让动物再探测两种气味再过10分钟，然后再将它们放回保温笼中1小时。
检索：
1. 呈现所有四种气味，每组气味的空间位置交换。这个演示导致每个气味拥有独特的时空配置 - 新颖的位置和时间上遥远（NL / TD），熟悉的位置和时间上遥远（FL / TD），新颖的位置和时间上最近（NL / TR），熟悉的位置和时间最近（FL / TR）。
2. 将动物放回竞技场，让它们探索所有四种气味，持续5分钟。

数据分析

可以使用每次测试的最终暴露期间呈现的每种气味的调查时间来确定判别率。该比率计算为探索新颖和熟悉的气味背景配置所花费的时间之间的差异除以调查两种气味的总时间：

这里零值表示两种气味的相同调查。高达1的正值表示对新颖气味配置的偏好，而负值表示对熟悉的刺激的更大调查。应使用双尾单样本 t -test将每个判别比率与零（机会性能）进行比较。如果分析多个治疗条件，可以使用 t -test或单向ANOVA与测试组作为因子来比较组间的表现。

对于什么时候的内存测试，调查百分比的时间应该通过将调查一个配置所花费的时间（例如，NL / TD）除以调查所有气味乘以100％的时间来确定：
为了分析空间记忆，用新颖和熟悉的位置调查气味所花费的时间差异除以总调查时间：
对于时间记忆，调查早期和之后经历的气味所花费的时间差异除以总调查时间：

这里应使用双向ANOVA分析调查时间百分比，其中测试组和气味时空配置作为因素。在适当的情况下，Tukey的多重比较测试可用于事后比较。

笔记

应在每个测试日准备新鲜的气味。应注意不要在制备过程中污染气味。应使用多个相同的气味杯，使得没有动物对同一杯进行两次研究以避免气味标记影响气味调查。呈现的气味和它们在动物之间呈现的顺序是伪随机的。
所有笼子应用10％乙醇彻底擦拭，并在两次曝晒之间晾干。＆nbsp;
所有测试都应该从侧视图录制视频，以便以后进行评分。应在每次测试的检索阶段（最后5分钟）测量每种气味的调查时间。在编码阶段测量调查时间有助于识别和排除表现出过度偏见或厌恶任何特定气味的动物。＆nbsp;
评分应由对治疗条件无视的人进行。探索严格定义为抬头嗅探，指向气味源1厘米以内。该定义不包括使用气味杯进行坐下或作为饲养期间的支撑。额外的开销视频有助于评估“何时何地”内存测试。＆nbsp;
可以使用ANY-maze软件分析开销视频，以生成每个组在测试室内的位置的平均热图。动物在使用自发识别记忆任务的调查时间内表现出高度可变性的情况并不少见，因此使用大量动物可能需要观察群体之间的差异。＆nbsp;
对于空间和时间气味记忆测试（程序B和C），在健康的8-10周龄野生型小鼠中通常可以预期0.5的辨别率。在新颖的气味识别测试（程序D）中，小鼠通常表现出更高的辨别率，平均值为0.8。在测量何时何地测试（程序E）中的调查时间百分比时，可以预期小鼠显示指示其新奇偏好的调查模式，使得他们花费大约40％的时间用于调查NL / TD气味。，~20％调查每种FL / TD和NL / TR气味，~10％调查FL / TR气味。

致谢

这项研究的资金来自J.C.K.来自加拿大卫生研究院（CIHR）（MOP 496401）和加拿大自然科学与工程委员会（NSERC）（MOP 491009）。这些方案改编自Aqrabawi和Kim（2018）发表的先前实验。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

伦理

所有程序均符合加拿大动物保护协会（CCAC）和多伦多大学动物保护委员会的指导原则。

参考

Aqrabawi，A。J.和Kim J. C.（2018）。前嗅核的海马投影在情绪性气味记忆过程中差异性地传达时空信息。 Nat Commun 9：2735。
Barker，G.R.，Banks，P.J.，Scott，H.，Ralph，G。S.，Mitrophanous，K.A.，Wong，L.F.，Bashir，Z.I.，Uney，J.B。和Warburton，E.C。（2017）。通过不同的海马 - 前额联系保留的情景记忆的独立元素。 Nat Neurosci 20（2）：242-250。
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