材料和试剂

乳胶手套
实验工作服
铂丝（例如，CVS10替代铂丝，50厘米长x 0.2毫米直径，Sigma-Aldrich，目录号：EP1330）
高回收过滤器移液器吸头（例如，Corning，Axygen ® Maxymum Recovery ®，目录号：T-200-C-L-R-S）
台面保护板（GE Healthcare，Whatman ®，目录号：2300-916）
一次性刮刀（例如，Disposable smartSpatula，LevGo，目录号：17251）
1.5毫升螺旋盖管（无菌，刻度，圆锥形，例如，STARLAB，目录号：E1415-2231）
96孔板（组织培养板，圆底，透明，无菌，TPP Techno Plastic Products，目录号：92097）
仅在需要过滤L1幼虫阶段时：尼龙净过滤器，亲水，5μm孔径（例如，Merck，目录号：NY0509050，直径90 mm，或目录号：NY0502500，直径25 mm）
10厘米塑料培养皿
湿纸巾
电子。大肠杆菌 OP50 [ Caenorhabditis 遗传学中心（CGC），明尼苏达大学，GCD系，6-160 Jackson Hall，321 Church Street S.E.明尼阿波利斯，明尼苏达州55455， https://cgc.umn.edu/ ]
实验对照菌株可在 C获得。线索明尼苏达大学遗传学中心（CGC）， https://cgc.umn.edu/）：
1. TG2435野生型回交BY200衍生物， vtIs1 [ pdat-1 :: gfp ; rol-6 ] V（而 pdat-1 :: gfp 始终表示，滚子表型的外显率非常低，很少可检测到）
2. TG2400 dat-1（ok157） III; vtIs1 V
3. TG4100 vtIs1 V; glit-1（gt1981） X.
4. TG2436 vtIs1 V; tsp-17（tm4995） X.
5. G4103 ttr-33（gt1983） V; vtIs1 V.
注意：我们建议研究人员将其野生型菌株回交至少4次。
M9缓冲区（He，2011）
线虫生长培养基（NGM）琼脂（He，2011）
LB（Luria-Bertani）液体培养基（参见Cold Spring Harbor Protocols，2006）
6-羟基多巴胺（6-OHDA）盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：H4381）（在黑暗中保持-20℃，新鲜制备原液）
L-抗坏血酸（Sigma-Aldrich，目录号：A5960，≥90％）（在室温下避光保存，用铝箔包裹等分试样）
200 mM抗坏血酸溶液（新鲜配制，参见食谱）
10 mM 6-OHDA溶液（新鲜配制，参见食谱）

设备

移液器
金属接种循环
精密秤
温度控制振动器（例如，Eppendorf，型号：ThermoMixer ® R）
温度控制培养箱（20°C）
通风柜
涡旋混合器（例如，科学工业，型号：Vortex-Genie 2）
乙醇燃烧器（例如。，DWK Life Sciences，Wheaton TM 酒精燃烧器，目录号：237070）
具有荧光的立体显微镜（例如，Leica）

软件

R studio（版本1.0.44）

程序

准备工作
1. 准备NGM板并在37°C下干燥过夜。在4°C下储存未种子的板。＆nbsp;
2. 将板转移至室温，然后用 ca。 1 ml OP50 E覆盖。大肠杆菌。我们准备 E.通过在500ml LB培养基中接种单个菌落的OP50并在37℃下孵育过夜来进行大肠杆菌培养。＆nbsp;
3. 将这些接种的板干燥过夜并将其储存在20℃。
4. 保持 C.线虫在20°C的标准条件下（Brenner，1974）在含有线虫生长培养基（NGM）琼脂和OP50细菌食物的10cm塑料培养皿上。
  注意：对于6-OHDA实验，N2衍生的BY200 C.elegans菌株可用作野生型对照，dat-1作为6-OHDA抗性菌株（Nass等，2002）和突变菌株tsp-17（Masoudi等，2014），glit-1（Offenburger等，2018b）或ttr-33（Offenburger等，2018a）作为6-OHDA敏感突变体。 >
6-OHDA测定（图1）

图1. 6-OHDA测定的每日时间表概述。请参阅文字了解详情。
1. 在6-OHDA测定前一天，选择妊娠 C.线虫（在成人阶段并且充满卵子）到每孔含有70μlM9缓冲液的96孔板中。这些70μl中只有30μl将用于6-OHDA处理，但由于大量液体会蒸发，因此需要准备更大的体积。最佳做法是选择健康的第1天或第2天成人，适用于所有条件和重复。
  注意：我们建议避开板边缘的井（分别为A和H行，以及第1和第12列），因为最外层井中的液体蒸发量增加。
2. 使用铂丝将10名成人转移到每个孔中，尽可能减少细菌携带，因为96孔板中的细菌生长会影响 C的同步。线虫 L1阶段幼虫。
  注意：如有必要，首先将蠕虫转移到空的NGM板上几秒钟，然后将从细菌中爬出的干净动物移到96孔板上。＆nbsp;
3. 为每个实验准备技术副本（即，每个条件两个孔）并在不同的日子进行至少两次生物学重复。我们鼓励随机化分析菌株的序列（图2）。
  
  图2.氧化应激测定设计的示意图。 C.线虫在96孔板中暴露于液体中。该测定以技术复制品（每剂量a + b行）进行，包括阴性和阳性对照。我们鼓励在生物学重复（A + B）之间随机化对照菌株的位置。生物学重复必须在不同的日子进行。红色梯度表示药物剂量的增加。我们通常使用0.75mM，10mM，25mM和50mM 6-OHDA的剂量。我们建议避免在板的边缘（A行和H行以及第1列和第12列）上的井，因为最外面的井中的液体显示蒸发增加。添加化合物时，我们保持相同的移液顺序（用灰色箭头表示），以确保所有测试菌株均等接触。
4. 将96孔板在温度控制的振荡器中以500rpm在20℃孵育24-40小时。由于井中没有食物，这些成虫产下的卵将孵化但仍留在L1幼虫期，从而提供发育同步的培养。我们对所有实验使用30小时的孵育时间，并鼓励标准化这个时间间隔，因为饥饿使动物对6-OHDA处理更具抗性（González-Hunt et al。，2014; Offenburger 等人。，2018b）。 30小时后，将在孔中积累数百个L1，其中仅约200个将用于测定，并且在处理后将仅对50-100个随机选择的动物进行评分。＆nbsp;
5. 在6-OHDA处理当天，首先准备恢复板。在背面标记含有6厘米板的NGM琼脂，并在96孔板上标记相应的字母/数字代码，并划线OP50 E。使用金属接种环在NGM上进行大肠杆菌（图3A）。
  注意：
  1. 其他项目可用于划线OP50。然而，重要的是不要损坏琼脂表面，否则动物可能会埋入琼脂中，因此会因为得分而丢失。＆nbsp;
  2. 为了确保在分析大量动物时食物不会耗尽，可以划出浓缩细菌（OP50大肠杆菌以> 15,000 xg离心5分钟并重悬于1/10体积的LB培养基中）。
6. 在即将处理动物之前，在螺旋盖管中制备200mM抗坏血酸储备溶液和5x在MilliQ水中的6-OHDA储备溶液。每孔需要10μl抗坏血酸储备溶液和10μl6-OHDA储备溶液，总体积为50μl。 1：5稀释导致终浓度为40mM抗坏血酸和1×6-OHDA（我们常用，在我们的实验中为0.75,10,25或50mM 6-OHDA）。抗坏血酸是一种抗氧化剂，可防止6-OHDA的自动氧化。
  注意：处理6-OHDA时，请戴上双层手套和实验室外套，使用一次性过滤器吸头并在通风橱下工作。在通风橱中使用一次性工作台盖，并将湿纸巾放在处理6-OHDA的区域，以便溢出的6-OHDA立即被氧化。
7. 使用一次性刮刀和通风橱中的精密秤称重螺旋盖管中的抗坏血酸和6-OHDA。为了尽量减少处理时间，称量一个近似的，稍高的化合物量并相应地调整总体积。＆nbsp;
8. 分离6-OHDA废料并妥善处理。尝试使用相同批次的6-OHDA，因为生产批次之间的功效可能不同。彻底涡旋抗坏血酸溶液和6-OHDA溶液约1分钟，直到溶解溶液并且溶液看起来均匀。
  注意：螺旋盖有助于确保管在混合过程中保持关闭状态。如果使用多种不同浓度或浓度较低的浓度，请从相同的储备溶液中制备稀释系列。
9. 使用非粘性过滤嘴将M9缓冲液（相当于200只以上的动物）中的30μl蠕虫等分到新孔中，以使动物损失最小化。
  注意：精确的多通道移液器可用于转移动物。在此阶段，技术重复不会混杂在一起。如果各孔之间动物密度差异很大，可以通过稀释M9缓冲液中的蠕虫来调节，使总体积达到30μl。
10. 在添加化合物之前，如果已经转移了足够多的动物（每孔至少50只动物），请用立体显微镜检查。＆nbsp;
11. 然后加入10μl抗坏血酸溶液并在工作台上敲入96孔板或短时间离心培养板以确保在加入6-OHDA之前适当混合内容物。
  注意：井壁上不应留有抗坏血酸溶液滴。不久摇动平板以确保孔中抗坏血酸的均匀分布。为防止6-OHDA的自动氧化，必须首先加入抗坏血酸。可以使用精确的多通道移液器来分配试剂。
12. 加入10μl5x6-OHDA溶液，再次确保溶液适当混合。在20℃下以500rpm摇动多孔板1小时。
13. 通过添加150μlM9缓冲液停止孵育。该缓冲液会氧化6-OHDA，溶液会变成粉红色至深红色。添加缓冲液后的颜色强度是所用6-OHDA浓度的良好指标。＆nbsp;
14. 将总共200μl的蠕虫吸移到与细菌条纹相对的NGM板上的氧化6-OHDA溶液中，直接在板标签的顶部（图3B）。＆nbsp;
15. 打开盖子，让平板在通风橱下干燥。当6-OHDA溶液浸泡到NGM中时，用铂丝移除成年动物和卵，使得仅在L1阶段暴露的动物保留在平板上（图3C）。除非与表现出发育缺陷的突变菌株一起工作，否则通常没有卵或非常少的卵存在，因为所有后代将在测定前的24-40小时孵育时间内孵化。保留在评分板上的L1幼虫将向细菌条纹迁移，细菌条纹提供食物来源（图3D）。
  
  图3.恢复板的布局。 A. 6 cm NGM培养皿，背面标有孔号（例如，1A），并接种一条OP50 电子。大肠杆菌（橙色条纹）。 B.将成年和L1阶段动物的混合物和未氧化的卵在氧化的6-OHDA（红色液体）中加入到与细菌条纹相对的一侧的平板中。 C.用铂丝除去成年动物和未孵化的卵。 D.剩余的L1阶段幼虫将向细菌条纹迁移，从而获得方便的评分。
16. 每天检查盘子，确保细菌食物不会用完。如果剩下的食物很少，添加一滴（ ca。50-100μl）浓缩的 E。大肠杆菌以防止动物饥饿。暴露后24,48或72小时可观察到多巴胺能神经变性。实验者应该对基因型不知情。 ℃。线虫多巴胺能头部神经元（图4A）显示对6-OHDA的差异敏感性，CEP神经元比ADE神经元更敏感（Nass et al。，2002; Tucci et al 。，2011）。中间体中的PDE多巴胺能神经元仅出现在L1幼虫阶段之后并且在我们的实验中没有评分。每个重复平板评分至少50只动物，导致每种条件下至少100只评分动物的总数。随机选择动物进行评分。我们使用四个类别进行评分：（1）CEP + ADE神经元完整，（2）CEP神经元部分受损，ADE神经元完整，（3）仅剩下ADE神经元，（4）没有留下CEP或ADE神经元（图中的图例） 4B，表1）。该测定可用于遗传筛选以寻找过敏性突变体（图4B），分析不同浓度的6-OHDA的不同突变之间的上位性（图4C），或在暴露于其他可溶性化合物如百草枯时分析动物（图4D）。
  
  图4.来自氧化应激测定的代表性读数。图A和B改编自Offenburger 等（2018a），图C和D改编自Offenburger 等人（2018b）。 A.荧光标记 C.在携带 vtIs1 转基因的野生型菌株中的线虫多巴胺能头部神经元（左）和没有（顶部）并且暴露于50mM 6-OHDA的示意性标记（右）（'+处理后72小时，6-OHDA'，底部）。 ADE神经元位于CEP神经元的后面。 B.在暴露于10mM 6-OHDA后24,48和72小时剩余的多巴胺能头部神经元和在BY200野生型动物和分离的过敏突变体中仅用抗坏血酸（'72h Ctr'）对照处理后72小时。 > TTR-33（gt1983）。误差棒= 3个生物重复的SEM，每个菌株每个菌株60-120只。每个条件的动物总数在'72h Ctr'时n = 30，在所有其他条件下n = 220-340（**** P <0.0001; G > - 比较同一时间点的野生型和突变体数据）。 C.用0.75mM 6-OHDA处理24,48和72小时后野生型和 glit-1 和 tsp-17 单和双突变体中的多巴胺能头神经元和仅用抗坏血酸（'72h Ctr'）对照处理后72小时。误差棒= 2-3个生物重复的SEM，每个重复60-115只动物。每个条件的动物总数对于'72h Ctr'条件n = 60并且对于所有其他条件n = 180-350（ ns P > 0.05; G - 测试）。 D.与50mM百草枯孵育1小时后24小时发育至L3阶段的动物的百分比。误差棒= 3个生物重复的SEM，每个菌株每个菌株和浓度为85-380只动物。每个条件的动物总数n = 340-830（ ns P > 0.05;双尾 t - 测试 tsp-17（tm4995）和 glit-1（gt1981）单个突变体到 tsp-17（tm4995）; glit-1（gt1981）双突变体在2 mM和3 mM百草枯）。
  
  表1.菌株a和b的实例评分。每个类别中的动物数量（技术副本的总和）。

数据分析

我们使用Microsoft Excel中的“100％Stacked Colum”图表显示评分结果。我们将技术副本中排除的数字和排除的数据点相加，其中技术副本之间的标准差在任何评分类别中高于20％。
＆NBSP;为了确定统计显着性，我们使用R Studio（版本1.0.44）的'DescTools'包执行了 G -Test。该软件包加载了'library（DescTools）'。为了比较两个菌株a和b与神经元评分类别1-4中相应数量的神经元，基质'mat'由mat = cbind（c（1a，2a，3a，4a），c（1b，2b）定义。，3B，4B））。使用'GTest（mat）'对该矩阵进行 G - 测试。结果以 P - 值给出。

例如上面的代码：
＆gt;库（DescTools）
＆gt; mat = cbind（c（12,2,18,86），c（20,5,28,54））
＆gt; GTest（垫子）

输出例如上面：
没有校正的独立性的对数似然比（G-检验）测试
data：mat
G = 12.382，X平方df = 3，p值= 0.006182

笔记

为了比较菌株之间的结果，最佳实践是始终并行测试它们，因为测定之间会有变化。
测试 C中的药物反应。不同生命周期阶段的线虫，将混合的动物群体暴露于6-OHDA并转移 C.使用铂丝分离刻痕板的不同阶段的线虫。
如果使用表现出游泳缺陷的菌株（例如 unc 突变体），通过洗掉一盘混合阶段动物并使它们通过5μm尼龙网过滤器同步L1阶段动物而不会饥饿。将保留除L1以外的所有其他阶段的动物。
目标是在所有实验中使用相同批次的6-OHDA，因为批次之间的效率可以变化。还要记住，6-OHDA可能会在打开后随着时间的推移而氧化，因此随着时间的推移，较旧的批次可能会变得不那么有效。
必须在处理动物之前立即新鲜制备抗坏血酸溶液和6-OHDA溶液以避免化合物的氧化。
准备至少100μl的每种抗坏血酸溶液和6-OHDA溶液，否则量将太小而无法准确称量它们。
在添加M9缓冲液之前，溶液应该看起来是透明的。粉红色溶液表明6-OHDA的氧化，其不会引起神经变性。
在准备qRT-PCR时，可以在螺旋盖管中处理更多数量的动物并且更高的总体积例如。对于大型方法，同步L1可以通过大板的饥饿（保持饥饿时间尽可能短）或通过用5μm尼龙网过滤器过滤大的混合动物群来获得。
如果该方案用于百草枯测定，则在评分板上吸取有限数量的动物（ ca。 100）。计算转移的动物总数，以表示达到L3阶段的动物数量百分比。

食谱

200 mM抗坏血酸溶液（100μl）
称重3.52mg抗坏血酸（MW = 176.12g / mol）
彻底涡旋溶液约1分钟，直到薄片溶解并且溶液看起来均匀
10mM 6-OHDA溶液（100μl）
称取1.03mg 6-OHDA（MW = 205.64g / mol）彻底涡旋溶液约1分钟，直至看起来均匀。

致谢

该协议改编自先前的工作（Nass et al。，2002; Masoudi et al。，2014），我们感谢Neda Masoudi的建议。这项工作的资金来自Wellcome Trust Program授予AG（0909444 / Z / 09 / Z， https：// wellcome。 ac.uk/funding ）和帕金森的英国拨款（G0912， https：/ /www.parkinsons.org.uk/research/research-grants ）以及Wellcome Trust战略奖（097045 / B / 11 / Z）的基础设施资金。我们感谢Dundee成像设施，该设施得到了Wellcome Trust技术平台奖（097945 / B / 11 / Z）和MRC下一代光学显微镜奖（MR / K015869 / 1）的支持。 SLO得到了博士学位的支持。由Wellcome Trust资助的分子和细胞生物学计划以及来自Wellcome Trust的ISSF资助的奖学金。一些菌株由CGC提供，由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

参考

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González-Hunt，C.P.，Leung，M.C.，Bodhicharla，R.K.，McKeever，M.G.，Arrant，A.E.，Margillo，K.M.，Ryde，I.T.，Cyr，D.D.，Kosmaczewski，S.G.，Hammarlund，M。和Meyer，J.N。（2014）。 Caenorhabditis elegans 中线粒体基因毒素和多巴胺能神经变性的接触。 PLoS One 9（12）：e114459。
他，F。（2011）。常见蠕虫媒体和缓冲区。 Bio-protocol / Bio101 1：e55 。
LB（Luria-Bertani）液体培养基。（2006年）。 Cold Spring Harb Protoc pdb.rec8141。 DOI：10.1101 / pdb.rec8141。
Masoudi，N.，Ibanez-Cruceyra，P.，Offenburger，S.L。，Holmes，A。和Gartner，A。（2014）。 Tetraspanin（TSP-17）在 C中保护多巴胺能神经元免受6-OHDA诱导的神经变性。线虫。 PLoS Genet 10（12）：e1004767。
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Nass，R.，Miller，D。M.和Blakely，R。D.（2001）。 C.线虫：研究帕金森病的新型药物遗传学模型。帕金森症相关性疾病 7（3）：185-191。
Offenburger，S.L.，Ho，X.Y.，Tachie-Menson，T.，Coakley，S.，Hilliard，M.A。和Gartner，A。（2018a）。 Caenorhabditis elegans 中的6-OHDA诱导的多巴胺能神经变性由吞噬途径并被转甲状腺素蛋白相关蛋白TTR-33抑制。 PLoS Genet 14（1）：e1007125。
Offenburger，S.L.，Jongsma，E。和Gartner，A。（2018b）。 Caenorhabditis elegans neuroligin-like glit-1 <的突变/ ，凋亡途径和钙伴侣 crt-1 在6-OHDA处理后增加多巴胺能神经变性。 PLoS Genet 14（1）：e1007106。
Schober，A。（2004）。经典毒素诱发的帕金森病动物模型：6-OHDA和MPTP。细胞组织分析 318（1）：215-224。
Sulston，J.，Dew，M。和Brenner，S。（1975）。线虫中的多巴胺能神经元 Caenorhabditis elegans 。 J Comp Neurol 163（2）：215-226。
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