材料和试剂

无菌锥形瓶250毫升（Corning，PYREX ®，目录号：4980-250）
无菌50毫升锥形管（Stellar Scientific，目录号：T50-100）
用于制备大量培养物的烧瓶（尺寸取决于实验目标）
幼苗托盘（带孔的36个细胞插入物）（J＆amp; P Park Acquisitions，Park Seed，目录号：96377）
平托盘（温室大型超市，11“W x 21.37”L x 2.44“D，CN-FL）
1.5 ml微量离心管（Sigma-Aldrich，BRAND，目录号：Z336769）
8厘米宽的盆（温室大型超市）
种植枝（温室大型超市）
金属珠（2.4 mm）（OMNI，目录号：19-640）
珠子打管（USA Scientific，目录号：1420-9300）
Gosselin Square聚苯乙烯培养皿，带4个通风口，120 x 120 x 15.8 mm，无菌（Corning，目录号：BP124-05）
Micropore TM 手术纸胶带（1英寸）（3M，目录号：1530-1）
铝箔（W.W.Grainger，目录号：16W479）
纸巾（单层纸巾，9.1 x 10.25）（Cascades Pro，目录号：H165）
Whatman TM 论文（1级定性滤纸）（GE Healthcare，Whatman）
培养皿（Corning，Falcon ®，目录号：351029）
0.22-μm无菌过滤器（默克，目录号：SLGP033RS）
10 ml移液器（一次性聚苯乙烯血清移液器）（Corning，Falcon ®，目录号：357551）
1毫升注射器（新的无菌，密封，结核菌素，鲁尔滑管，无针，一次性）（BD，目录号：9602）
96孔半区域微孔板（Corning，目录号：3697）
土壤混合物，繁殖混合物，Sunshine ®韧性硅富集，Re Plug和Seed Rsi（Sun Gro园艺，批号：Q15322; SKU：7263924）
成分：
55-65％加拿大泥炭藓，蛭石，白云石，润湿剂;
来自硅酸钙的0.0001％二氧化硅（SiO 2 ）以增加根生长
Ralstonia solanacearum 菌株来自甘油或水原液
Bonny最好的枯萎病易感品种番茄种子（山谷种子）（储存在4°C）
Milli-Q系统（SMQ）无菌反渗透水
琼脂（Fisher Scientific，目录号：BP1423-2）
漂白剂（Clorox Performance Bleach with CloroMax）（The Clorox Company，目录号：980042447）
70％乙醇（稀释100％乙醇200证明）（Decon Labs，目录号：2716）
葡萄糖（Fisher Scientific，目录号：D16-1）
蛋白胨（Fisher Scientific，目录号：NC9931583）
酪蛋白氨基酸（RPI，目录号：C45000-5000.0）
酵母提取物（Fisher Scientific，目录号：BP1422-2）
KOH（Fisher Scientific，目录号：P250 10）
1％2,3,5-三苯基四唑氯化物（TZC）（Sigma-Aldrich，目录号：T8877）
KNO 3 （Fisher Scientific，目录号：P383 100）
KH 2 PO 4 （Merck，Calbiochem，目录号：529568）
MgSO 4 （MP biomedicals，目录号：150136）
Ca（NO 3 ） 2 •4H 2 O（Fisher Scientific，目录号：C109）
H 3 BO 3 （Fisher Scientific，目录号：A73 1）
MnCl 2 •4H 2 O（Sigma-Aldrich，目录号：M8054）
ZnSO 4 •7H 2 O（Fisher Scientific，目录号：Z68）
CuSO 4 •5H 2 O（VWR，BDH，目录号：BDH9312）
（NH 4 ） 6 Mo 7 O 24 （Sigma-Aldrich，目录号：A1343）
FeSO 4 •7H 2 O（Fisher Scientific，目录号：I146 3）
Na 2 EDTA（Fisher Scientific，目录号：S311）＆nbsp;
酪蛋白氨基酸 - 蛋白胨 - 葡萄糖（CPG）琼脂（见食谱）
CPG肉汤（见食谱）
修改了Hoagland的解决方案（见食谱）

注意：所有化学品均购自Sigma-Aldrich，Fisher Scientific或其他化学公司。

设备

P1000移液器（Eppendorf，目录号：3120000062）
P200移液器（Eppendorf，目录号：3120000054）
P10移液器（Eppendorf，目录号：3120000020）
镊子（VWR，目录号：470018-952）
制造商：Dunrite Instruments，目录号：141001。
手术刀（Bard-Parker ® SafeSwitch TM 可重复使用的手术刀手柄，尺寸3 L）（Aspen Surgical，目录号：ST-1013LNS）
锋利的剃须刀片（碳钢剃刀刀片）（Azpack，目录号：YSJ-762-Q）
孵化器（6M Lab Incubator）（Precision Scientific，目录号：31487）
台式振荡器（Thermo Fisher Scientific，型号：MaxQ TM 4000）
生长室具有以下条件：
光强度：300-500μmol/ m 2 •sec -1
12小时，光照，28°C
12小时，黑暗，28°C
湿度50-70％
测量~500ppm CO 2
Powerlyzer ® 24均质器（MO BiO Laboratories，目录号：13155）
离心机（15安培型）（Eppendorf，型号：5810 R）
离心机（Eppendorf，型号：5417 R）
分光光度计（UV / Vis）（Beckman Coulter，型号：DU 730）
涡旋混合器（Vortex-Genie 2）（科学产业，目录号：SI-0246）
生物安全柜（The Baker，SterilGard ®，型号：SG403A-HE）
Balance（Roche Diagnostics，型号：05942861001）
高压灭菌器（真空蒸汽灭菌器）（Getinge，型号：533LS-E）

软件

PRISM Graphpad软件

程序

本节包括从程序A到程序I的小节：

准备细菌培养物进行土壤浸泡（取决于实验目标，本小节可以遵循程序C-F或C-E-G或C-G）
播种和移植番茄植物 - 本小节描述了如何种植番茄植物以确保土壤浸泡或叶柄接种（C或D）的可重复结果，然后可以测量疾病进展（F）或竞争和细菌定植（E和/或G）。＆nbsp;
土壤浸泡接种 - 将稀释的细菌悬浮液倒入含有未受伤的番茄植物的盆中，这与自然根感染过程非常相似。这种方法的感染是随机的。该程序可以是程序E或F或G或H，或E-G。
叶柄接种 - 这种替代接种程序不太自然，但允许确定特定基因是否有助于 R. solanacearum 在宿主茎上成功。叶柄接种也可确保同步感染。（此程序可用于程序E或F或G或H，或E-G。）＆nbsp;
竞争测定 - 量化野生型和突变体 R的相对竞争适合度。 solanacearum ，我们测量接种后3至7天或之后（取决于实验目标）茎中的细菌定植（程序G）。＆nbsp;
疾病进展曲线 - 该程序用于量化土壤浸泡（程序C）或叶柄接种（程序D）后的青枯病发展。＆nbsp;
细菌定植 - 该程序用于测量细菌定殖根（感染的早期阶段）或干细胞（感染的后期阶段）的能力。该方法量化了 R.土壤浸泡（程序C）或叶柄接种（程序D）或竞争试验（程序E）后，植物中
Xylem sap collection - 离体番茄木质部汁液可用于代谢组学分析或作为细菌生长的培养基。通常植物受自然土壤浸泡法感染（程序A-B-C）。＆nbsp;
根附着分析 - 量化突变体与野生型细菌附着于番茄幼苗根部的能力，这是 R的最初步骤之一。 solanacearum 植物感染。＆nbsp;

准备细菌培养土壤浸泡
1. 在CPG + TZC板上从水原液或甘油原液中划出 Ralstonia solanacearum ，并使其在28°C静态培养箱中生长48至72小时。
  注意：确保菌落的形态是野生型（WT）而不是自发的phcA样突变体（Khokhani等，2017）。
2. 一旦你看到平板上的分离菌落，挑选一个菌落在250毫升无菌烧瓶中接种100毫升CPG肉汤（含有适当的抗生素），在摇床培养箱中以220转/分钟培养过夜（18-20小时）， 28°C。
3. 将过夜培养物在50ml锥形管中离心（6,900 x g ，5分钟）两次，以沉淀所有100ml细胞培养物。丢弃上清液。
  注意：当您倒出上清液时，一些EPS也会脱落，这是一个很好的迹象，表明培养物没有被自发的phcA污染，如不会产生野生型EPS的突变体。
4. 使用P1000移液管将细胞沉淀重悬于20ml无菌MilliQ（SMQ）水中，然后加入剩余的30ml SMQ水并通过涡旋混合均匀。
5. 通过在1.5ml Eppendorf管中的900μlSMQ水中移取100μl重悬的细胞培养物，在SMQ中将其稀释10倍，测量过夜细胞培养物的光密度（λ= 600nm，在分光光度计中）。
  示例：如果稀释后OD 600 为0.5，则实际OD 600 为5.0。
6. 计算在OD 600 = 0.1时产生所需体积的细菌悬浮液所需的原始细胞悬浮液的体积，其对应于约10 8 CFU / ml。
  对于一个具有10个技术重复的生物复制品，我们进行以下数学计算：
  对于土壤浸泡接种，我们每盆加入5×10 9个细胞（50ml 0.1 OD 600 细胞悬浮液）。总的来说，我们需要10 x 50 ml = 500 ml的细胞悬液。因此，对于500ml的0.1OD 600 培养物，我们需要10ml的5.0OD 600 重悬细胞培养物和剩余的490ml SMQ水。
  注意：加一点额外的接种物，这样你就不会因为移液错误而耗尽最后一个罐子的细胞。通常，每个菌株含有14-20个技术重复（植物）的三个生物重复用于统计分析。
7. 再次检查OD 600 以确保其大约为0.1和稀释板以确认最终的接种细胞密度。
  注意：请参阅附Excel表用于计算。
播种和移栽番茄种子
1. 将干燥的灌封混合物加入幼苗托盘中，轻轻按压。
2. 在每个细胞中放置4-5粒Bonny Best（易受细菌枯萎病的品种）的种子。
  注意：我们已确定番茄cv。赚钱的人也同样容易受到青枯病的影响。
3. 用一层薄（1-3毫米）的灌封混合物覆盖它们，如图1所示。
  
  图1.将番茄种子播种在多锅托盘中
4. 小心地给土壤浇水，直到土壤潮湿而不被淹没。
5. 将培养皿在28°C的生长室中孵育12小时光照/ 12小时黑暗循环。注意：生长室中的高光强度对于良好的疾病发展至关重要。
6. 在没有淹没托盘的情况下给土壤浇水（水不应流出托盘）。每天早上大约在同一时间给植物浇水。
7. 在种植后的第13天日停止给幼苗托盘浇水，使土壤稍微干燥。这使得土壤很容易轻微地从幼苗上脱落，并且很容易将幼苗转移到较大的盆中。如果土壤湿润，许多根可以轻轻摇动甚至收支平衡。
8. 在第14天天（图2），将幼苗从幼苗托盘转移到较大的盆中（图3），仔细地脱落土壤（尽可能不破坏根部）。为了去除土壤，在土壤掉落时轻轻敲打根球。
  
  图2.第14天的幼苗生长种植种子
  
  图3.带有土壤混合物的移植罐准备转移14日龄番茄幼苗
9. 用灌封混合物填充直径8厘米的塑料盆。重要的是不要压缩土壤以避免在盆中产生厌氧条件。
10. 给土壤浇水，直到它被弄湿但没有被淹没，用食指或Sharpie在锅的中心开一个洞。
11. 将幼苗放在盆中，当所有盆都有幼苗时，将每个幼苗放入一个洞中，轻轻按压幼苗基部周围的土壤，使其得到良好的支撑，并在浇水后不会翻倒。
12. 让西红柿在较大的盆中生长一周，直到它们21天大。第一片真叶应该完全展开，第二片真叶应该打开。
土壤浸泡接种试验
先前已使用以下方案（Huang和Allen，2000; Tans-Kersten 等人，2001; Colburn-Clifford 等人，2010）。
1. 根据土壤湿度，在接种前一天或两天停止给植物浇水。这将使土壤吸收倒入其中的所有细菌培养物。小心不要过度干燥，如 R.在干燥条件下，solanacearum 存活率下降。
2. 在接种番茄植物的前一天，开始如上述步骤A1中所述的 Ralstonia solanacearum 的过夜培养物。
3. 在接种当天，按照步骤A2至A7进行。
4. 准备好细菌培养物后，对接种物进行稀释平板培养，并将CPG平板培养约48小时以计数菌落数。这将证实OD 600 约为0.1，并且在制备期间细菌细胞未被污染或杀死。
5. 要对植物进行盲目评估（首选程序），请同事对您的接种瓶（例如，用彩色胶带）进行编码，并从烧瓶中取出识别菌株标签。同事可以保留应变代码列表，直到您准备好在实验完成后分析数据。
6. 使用50ml锥形管测量50ml细菌悬浮液，并将其倒入每个罐中。您可以针对所有目标菌株进行同样的测试，以检测其毒力，但每种细菌菌株仅使用一个管。确保将种植棒放入盆中以标记植物以用于未来的疾病评级（图4）。不要伤害植物。
  
  图4.种植盆准备接种的盆栽
7. 几个小时内检查土壤水分。为了获得一致的结果，接种后几天土壤不应干燥。干燥的土壤会降低细菌活力，延缓疾病发作。
8. 接种后，用Hoagland溶液在一天后给植物浇水。剩余的13天使用自来水给植物浇水。
注意：如果疾病发育不良，可以操纵以下变量：a）植物年龄。使用较年轻的植物（种植后18或19天）; b）湿度。确保生长室湿度至少为65％; c）接种密度。通常，接种后14天，野生型R. solanacearum在接种50 ml 1 x 10 8 后，导致平均疾病指数为3.5或更高 CFU悬浮液（OD 600 = 0.1）。如果需要，接种物可以增加到OD 600 = 0.2。
叶柄接种试验
以下协议已用于（Brown和Allen，2004; Dalsing和Allen，2014）。
注意：按照程序B中提到的所有步骤，在植物生长的所有21天内给植物浇水。
1. 在接种前一天，开始5ml过夜的 R的CPG培养物。雷尔氏菌。
2. 在接种当天，首先在早晨给植物（现在21日龄）浇水，然后进行接种。
3. 第二天，旋转1ml过夜培养物，并将沉淀重悬于1ml SMQ水中。
4. 测量OD 600 并稀释SMQ H 2 O中的细菌悬浮液，以制备2ml OD 600 = 0.1细菌细胞悬浮液。
5. 在向前移动之前，通过分光光度计和稀释电镀确认OD 600 ，如步骤A6中所述。
6. 将0.1OD细胞悬浮液稀释至OD 600 = 0.001。
7. 为了感染植物，用锋利的剃刀刀片切除叶柄底部附近的第一片真叶。叶柄应对角切割，平行于地面，以形成一个水平表面，在这里可以施加一滴细菌而不会沿着茎干向下移动（图5）。
  
  图5. 21日龄番茄植株的叶柄接种。蓝色箭头表示切割叶柄的水平残端，其中放置了2μl细菌细胞悬浮液。
8. 使用10ml移液管在切割的叶柄表面上小心地放置2μlOD 600 = 0.001细胞悬浮液（相当于2,000个细胞）。可以根据实验目标改变细胞数量。液滴很快被植物吸收，表明细菌被拉入木质部。
9. 您可以在一个托盘中切割植物的所有叶柄，然后将细菌应用于每个植物。例如，一次有10个工厂。
竞争试验测定植物中细菌菌株的相对竞争适合度
以下协议已用于（Yao和Allen，2006; Lowe et al。，2015）。
1. 为了测量目标菌株相对于另一种菌株（通常是野生型）的竞争适应性（Yao和Allen，2006），每种菌株必须具有不同的抗生素抗性。例如，如果野生型菌株是卡那霉素抗性的并且目标突变菌株是庆大霉素抗性的。
  注意：为了确保抗生素抗性标记基因不会增加标记菌株的适应性成本，比较标记菌株的植物生长与未标记亲本菌株的生长。
2. 在补充有所需抗生素的CPG平板上制备标记菌株的新鲜平板用于过夜培养。
3. 如程序B和C中所述种植植物。
4. 为了接种植物（在植物生长的第21天），分别制备两种竞争菌株的0.1OD 600 培养物。使用分光光度计检查OD 600 。
5. 将两种菌株以1：1的细菌群体比例组合。再次，稀释板检查实际细胞数。
6. 向每个罐中加入50ml这种混合细菌悬浮液用于自然土壤浸泡竞争，或者将2μl相同的悬浮液加入到切割的叶柄中用于叶柄接种竞争。
7. 为了检查根或茎定植，在接种后3至7天对植物进行取样。从这里开始，按照程序G.
注意：请参阅随附的Excel表格进行计算。
衡量疾病进展，并创造疾病进展曲线
1. 在对植物进行评级之前，先给植物浇水，等待1小时，然后通过寻找枯萎的叶子来记录疾病。我们以0到4的等级记录疾病。如果没有叶子枯萎，植物的评分为疾病指数（DI）= 0;如果24％或更少的叶面积枯萎，我们得分为DI = 1;如果25-49％枯萎，DI = 2; 50-74％，DI = 3;和75-100％，DI = 4。
2. 我们将疾病症状评定到接种后14天。枯萎症状通常在叶柄接种后3-4天或土壤浸泡接种后4-5天开始出现。
测量番茄根和茎的细菌定植
根系定殖的方案已被用于（Lowe et al。，2015），并且已经使用了茎定植（Dalsing et al。，2015; Lowe-Power et al。，2016）。
1. 样品采集取决于实验目标。请参阅已发表的文章，其中抽样时间以研究目标为指导。
2. 对于根系定植，将植物从盆中取出并轻轻摇晃尽可能多的土壤。＆nbsp;
3. 将植物放入装满水的容器中，让根部浸泡并轻轻洗净，直至所有土壤脱落。对每个处理的所有植物重复该过程。（图6A-6C）
4. 在漂白剂中洗涤根部15秒，然后在2个淡水浴中连续洗涤15秒并在组织上干燥30秒（图6D-6F）。
5. 切断胎冠连接处的根部（图6G）。
6. 收集根部并用剃刀刀片将其切成小块，以确保每个样品含有来自每个区域的根（图6H）。
7. 将最多300毫克的切根放入含有4个小金属珠和700μlSMQ水的制备的珠搅拌器管中。
8. 对于茎的定植，使用剃刀刀片在叶柄接种部位周围收获1厘米的茎（图6I）。
  
  图6.根（A-H）和茎定植（I）定量的步骤
9. 将最多100毫克切割的茎放入含有4个金属珠和900μlSMQ水的制备的研磨管中。
10. 使用Powerlyzer ®打珠机打磨组织，并进行以下设置：
  速度= 2,200rpm，时间= 1分30秒，停留时间= 4分钟，循环= 2，总时间= 7分钟
11. 通过将20μl每种稀释液与180μlSMQ混合，在96孔板中将匀浆系列稀释10倍。对于根样品：每个样品连续进行5次1:10稀释（10 0 -10 -4 ）;对于茎样品：每个样品连续进行7次1:10稀释（10 0 -10 -6 ）。
12. 将三种10μl各稀释液滴入CPG板（含有适当的抗生素）。通过在生物安全柜中打开盖子约15分钟来干燥板。
13. 将板在28℃孵育36-48小时并计数菌落。不允许殖民地一起成长。
  注意：将最终种群大小标准化为原始个体接种物中实际细菌数量的比例，通过接种物的稀释平板测定。请参阅随附的Excel表格进行计算。
Xylem根据压力收集汁液
以下协议改编自Goodger et al。（2005），用于Khokhani et al。（2017）和Lowe-Power 等。（2018）。
对于基础实验，我们每个时间点每个处理准备9株植物（取样是破坏性的）。 Sap将合并为3个池，每个池含有3株植物的汁液。由于切割不均匀，偶尔不能从植物中收集汁液，因此准备额外的植物是明智的。当植物处于充分浇水的土壤中时，根压会在一夜之间积累。根部压力在一天中降低。因此，汁液收集应该在光照开始的几个小时内发生，并且植物必须在汁液收集之前的晚上充分浇水。树液渗出率取决于许多变量，包括土壤含水量，植物大小和疾病状态。在Lowe-Power 等人描述的实验中。（2018），我们从26-31天的健康和枯萎症状（疾病指数1）植物中收获了473μl和280μl的中位数体积（图7B）。
准备工作：
1. 每株一管研磨组织以确定定植（4个金属珠和900μlSMQ水）＆nbsp;
2. 每株植物一管用于木质部汁液收集（数量，颜色代码，等），预先称重，在冰上预先冷却。如果可能，将所有管和植物排列在同一平行线上，以避免交叉污染样品。
3. 每株一管对树液进行消毒。
4. 每个游泳池一管。
5. 将计时器设置为33分钟。
6. 用锋利的剃刀刀片将番茄植物取出，以产生平坦的残端表面。如果树桩表面成角度，树液可能会从树干上滴下来。对于土壤浸泡接种的植物，在子叶上方切割约1厘米。对于切叶柄接种的植物，在接种部位正上方切割。一般来说，它可以很好地分批处理植物，每批次间隔5分钟。
7. 让第一滴液体积聚~2½分钟。然后用纸巾轻轻擦干树桩。使用P200移液器用无菌SMQ水清洗残端，然后再次吸干，以尽量减少细胞溶质污染。
8. 收集木质部汁液30分钟，始终使用新鲜的尖端并将每株植物的木质部汁液移液到相应的管中，该管保持在冰上。由于表面张力，树液应该作为气泡积聚（图7A）。如果树桩看起来很潮湿，但树液不会积聚，它会隐蔽地从树干上滴下来。轻轻地将树桩吸干干净可以恢复表面张力，使树液渗出并使其积聚。我们已经包括了从番茄植物中收集的木质部汁液量的估算（图7B）。
  
  图7.木质部汁液的收集。 A.去皮番茄植株上的木质部汁液。 B.样品数据集显示来自健康和受感染植物的木质部汁液体积。每个点代表从一个植物收集的汁液量。
9. 如上所述，保持植物顶部采集样品以量化每株植物的细菌定植（从茎的最低部分收集~50-100mg切片）。
10. 再次称量每个管以确定从每株植物获得的木质部汁液体积（密度类似于水，因此1 mg =1μl）。
11. 池应由来自植物的木质部汁液组成，产生高，中和低量的木质部汁液。对于汇集，将每株植物的等体积木质部汁液（例如，100μl）组合。使用1ml注射器和4mm直径0.22μm过滤器（4mm大小的过滤器减少样品损失）将来自每个植物的木质部汁液过滤灭菌到新鲜的1.5ml管中。
12. 该木质部汁液可用作生长曲线分析或代谢物分析的培养基。可以在Corning 96孔半区域微量培养板中用50μl树液进行细菌生长测定。代谢物分析所需的汁液量应根据目标代谢物的浓度和检测方法的灵敏度凭经验确定。
番茄幼苗的根附着物
以下协议已在Tran et al。（2016b）和Khokhani et al。（2017）中使用。
1. 将番茄种子浸泡在2％漂白剂中5分钟，然后用70％乙醇浸泡5分钟，然后用SMQ水冲洗6次，对番茄种子进行表面灭菌。
2. 在生物安全柜中使用无菌镊子的帮助，将灭菌的幼苗通过将其铺展到覆盖有无菌Whatman TM 滤纸的1％琼脂培养皿上进行转移。
3. 用Micropore TM 胶带密封培养皿并用铝箔覆盖以排除光。
4. 将板在28℃孵育4天。同时，准备1％琼脂方板，CPG + TZC +所需抗生素，珠子打浆管，4个金属珠和300μlSMQ水。
5. 在4 th 日，用锐利标记方形板的背面，如图所示（图8）。
  
  图8.标有2 cm区域的方形板，其中番茄幼苗的根部排列
6. 在生物安全柜中，安排番茄幼苗，使其根长度为2厘米（从根尖）。大约40个番茄幼苗可以容纳在一个方形板中，每侧20个。
7. 按步骤D2-D6所述制备细菌接种物。
8. 稀释平板接种物并在28℃下孵育平板以确认接种物密度。
9. 接下来，使用微量移液管小心地将10μlOD 600 = 0.001细菌悬浮液（~10,000个细胞）分布在方形板中每个根的2cm长度上。
10. 在室温下孵育方板2小时。
11. 两个小时后，使用无菌手术刀切下所有40根的尖锐标记所示的2厘米长度。
12. 将所有切根转移到含有SMQ水的培养皿中并旋转平板以去除松散附着的细菌细胞。在第一次漂洗后，将所有根部转移到另一个含有SMQ水的培养皿中并再次冲洗。
13. 接下来，将根部转移到新的纸巾上，轻轻拍干根部。一次转移4根。
14. 在干燥后，将每组4根转移到制备的含有金属珠和300μlSMQ水的珠搅拌器管中。对于40个根，每个生物重复每次处理将有10个技术重复。
15. 使用以下设置将包含切根的珠子打针管和金属珠放在Powerlyzer ®中：速度= 2,200 rpm，时间= 1分30秒，停留时间= 4分钟，周期= 2，总时间= 7分钟。
16. 研磨后，将匀浆与它们的1:10,1：100,1：1,000连续稀释液一起用于每个样品。
17. 48小时后，计数菌落以确定原始接种物中的细菌细胞数和附着于根部的细菌数。
18. 通过将从根部回收的细菌细胞数除以每厘米根中接种物中存在的细胞数来计算附着百分比。
  注意：请参阅随附的Excel表格进行计算。

数据分析

图9表示来自Dalsing 等人的疾病进展试验（2015）。如上所述，使用0至4疾病指数每天评价植物14天。所呈现的数据是3至4个独立测定的平均结果，每个测定每个菌株含有10株植物。误差棒表示均值的标准误差。 Δ aniA 和Δ hmpX 突变体的疾病进展曲线与WT株显着不同（ P <0.001，重复测量方差分析; ，PRISM Graphpad软件）。
＆NBSP;此处介绍的协议生成定量数据，需要深思熟虑，细致入微的分析。幸运的是，最近的一篇论文（Schandry，2017）提供了分析 R数据的详细实用指南。 solanacearum 感染，包括相关的R代码。

图9.来自Dalsing等人的一种毒力测定的样本疾病进展图。（2015）

笔记

定期校准移液器，尤其是用于稀释电镀的P10。＆nbsp;
每次新实验，都要使用一瓶新的SMQ水，以避免任何污染。＆nbsp;
定期检查你的菌株是否存在自发的 phcA 突变体。＆nbsp;
不要使用从水或冷冻库存中出苗后生长超过4天的CPG板的菌落接种。 “老”殖民地经常失去毒力。

食谱

酪蛋白氨基酸 - 蛋白胨 - 葡萄糖（CPG）琼脂（1L）
5克葡萄糖
10克蛋白胨
1克酪蛋白氨酸
1克酵母提取物
用1M KOH调节pH至6.5-7.0
16克琼脂
高压灭菌器在121°C，20分钟
1毫升1％2,3,5-三苯基四唑氯化物（TZC）（溶解于水中，过滤灭菌并在浇注板前加入CPG）
CPG肉汤（1升）
5克葡萄糖
10克蛋白胨
1克酪蛋白氨酸
1克酵母提取物
用KOH调节至pH 6.5-7.0
高压灭菌器
修改了Hoagland的解决方案
混合物
1.1 M KNO 3
0.2 M KH 2 PO 4
0.92 M MgSO 4
浇水时，使用4毫升/升水
硝酸钙
1.29 M Ca（NO 3 ） 2 •4H 2 O
浇水时，使用5毫升/升水
微量营养素
0.4626 M H 3 BO 3 （硼酸）
0.0915 M MnCl 2 •4H 2 O（氯化锰）
0.0077 M ZnSO 4 •7H 2 O（硫酸锌）
0.0032 M CuSO 4 •5H 2 O（硫酸铜）
0.0007 M（NH 4 ） 6 Mo 7 O 24 （钼酸）
浇水时，使用4毫升的库存/ L水
铁
FeSO 4 •7H 2 O（硫酸亚铁）25.02 g / 18 L水
Na 2 EDTA（乙二胺四乙酸）33.48 g / 18 L
将上述溶解在4L去离子RO水中。加热至80°C一小时。冷却至室温，加入去离子RO水至18L
浇水时，使用4毫升/升水

致谢

我们感谢Patrizia Ricca捕获土壤浸泡，根和茎定植的图像。我们还要感谢所有论文的作者，他们已经引用了这些论文来调整和/或修改他们的协议来执行各自的实验。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

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