材料和试剂

MicroAmp TM 无飞溅96孔碱基（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4312063）
1,000μl移液器吸头（Corning，Axygen ®，目录号：TF-1000-R-S）
200μl移液器吸头（Corning，Axygen ®，目录号：TF-200-R-S）
10μl移液器吸头（Corning，Axygen®，目录号：TF-300-R-S）
1毫升无需注射器（BD，目录号：309659）
1.5毫升无RNase管（Corning，Axygen ®，目录号：MCT-150-C）
Axygen ® 0.2 ml聚丙烯PCR管条（8管/条）（Corning，Axygen ®，目录号：PCR-0208-C）
具有条形码的MicroAmp TM 光学96孔反应板（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4306737）
MicroAmp TM 光学胶膜（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4360954）
纸巾
健康5-6周 N.本生植物植物（见图1）
任何感兴趣的PAMP和相应的控制解决方案
液氮
β-巯基乙醇（Solarbio，目录号：M8210）＆nbsp;
E.Z.N.A. ®总RNA试剂盒I（Omega Bio-Tek，目录号：R6834-01）
DNase / RNase-free ddH 2 O（Solarbio，目录号：R1600）
PrimeScript TM RT试剂盒，带有gDNA橡皮擦（完美实时）（Takara Bio，Clontech，目录号：RR047A）
TB Green TM Premix Ex Taq TM （Tli RNase H Plus）（Takara Bio，Clontech，目录号：RR420A）
1 mM flg22原液（Gene Script，RP19986）（见食谱）
1 mM XEG1原液（参见食谱）
70％乙醇（见食谱）

设备

研钵和研杵
生长室
NanoDrop TM 1000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：NanoDrop TM 1000）
Vortexer（科学工业，型号：Vortex-Genie 2，目录号：SI-0246）
冷离心机（Eppendorf，型号：5424 R，目录号：5404000014）
移液器100-1,000μl（Eppendorf，目录号：3120000062）
移液器10-100μl（Eppendorf，目录号：3120000046）
PCR热循环仪（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM ，型号：2720，目录号：ED000651）
MicroAmp TM 粘合剂涂膜器（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4333183）
MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner（Labnet International，目录号：C1000）
ABI 7500快速实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems TM ，目录号：4351107）

软件

Applied Biosystems序列检测软件v1.4.0

程序

Nicotiana benthamiana的渗透
1. ñ。本生树（benthamiana）植物在19-22℃的生长室中在长日照条件下（14小时光照/ 10小时黑暗）和70-80％相对湿度下生长5-6周，如图所示如图1所示。
  
  图1.用于PAMP处理的 Nicotiana benthamiana 植物
2. ñ。用PAMP（例如，flg22）或对照（例如，ddH 2 ）处理相同位置和相似大小的本生叶叶O）通过使用1ml无针注射器渗透（图2）。使用薄纸轻轻干燥渗透的植物，并在生长室中保持3-6小时，然后收集并在液氮中冷冻。
  
  图2. N的渗透。宾夕法尼亚州使用不必要的注射器
总RNA分离
从 N分离总RNA。 benthamiana 使用E.Z.N.A. ®总RNA试剂盒I分离试剂盒根据制造商的说明进行适当修改。
1. 收获 N.在PAMP处理后3-6小时，本生烟草离开。用研钵和研杵在液氮中将冷冻组织研磨成粉末。
2. 将叶粉转移到含有700μlTRK裂解缓冲液和14μlβ-巯基乙醇的1.5ml无RNase管中，将样品涡旋30秒，并将样品在4℃保持5-10分钟。
3. 将样品在15,000 x g 下于4°C离心5-10分钟，小心地将600μl上清液转移到新的1.5 ml无RNase管中。
4. 加入等体积（600μl）70％乙醇（参见配方）。
5. 将混合液体加入HiBind ® RNA Mini Column（组装的2ml收集管）中，在4℃下以10,000 x g 离心30秒。丢弃滤液并重新使用收集管。
6. 将300μlRNA洗涤缓冲液I加入HiBind ® RNA Mini柱中，在4℃下以10,000 x g 离心30秒。丢弃滤液并重新使用收集管。
7. 将500μlRNA洗涤缓冲液I加入HiBind ® RNA Mini柱中，在4℃下以10,000 x g 离心30秒。丢弃滤液并更换新的2 ml收集管。
8. 加入500μlRNA洗涤缓冲液II，在4℃下以10,000 x g 离心30秒。丢弃滤液并重新使用收集管。
9. 重复步骤B8。
10. 在10,000 x g 离心2分钟以完全干燥HiBind ® RNA Mini Column。
11. 将HiBind ® RNA Mini Column放入新的1.5 ml无RNase试管中，将50μl不含DNase / RNase的ddH 2 O加入柱中，让其置于室温1分钟。在4℃下以10,000 x g 离心1分钟，以从HiBind ® RNA Mini Column洗脱RNA。
12. 使用Nanodrop TM 1000测量RNA浓度。将洗脱的RNA保存在-70℃。
第一链cDNA合成
使用带有gDNA Eraser（完全实时）的PrimeScript TM RT试剂盒逆转录总RNA。
1. 去除gDNA反应
  反应混合物：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>5x gDNA橡皮擦缓冲液
  2μl
  gDNA橡皮擦
  1μl
  总RNA
  700纳克（计算量）
  DNase / RNase-free ddH _{2 O
  高达10μl 反应计划：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>42°C
  2分钟
  4°C
  ∞}
2. 逆转录反应
  反应混合物：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>步骤C1的反应溶液
  10μl
  PrimeScript TM RT Enzyme Mix I
  1μl
  RT Primer Mix
  1μl
  5x PrimeScript TM ＆nbsp;缓冲区2（实时）
  4μl
  DNase / RNase-free ddH _{2 O
  μl高达20μl 反应计划：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：400px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>37°C
  15分钟
  85°C
  5秒
  4°C
  ∞}
3. 用180μl无RNase的H 2 O稀释所得cDNA 20次。
定量实时PCR（qRT-PCR）
使用TB Green TM Premix Ex Taq TM 试剂盒（Tli RNase H Plus）进行qRT-PCR：
1. qRT-PCR反应混合物：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：500px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>2x TB Green TM ＆amp; Premix Ex Taq TM ＆nbsp;（Tli RNase H Plus）
  10μl
  50x ROX Reference Dye II
  0.4μl
  qRT-PCR正向引物
  0.4μl
  qRT-PCR反向引物
  0.4μl
  稀释的第一链cDNA
  5μl
  DNase / RNase-free ddH _{2 O
  高达20μl}
2. 将qRT-PCR反应混合物添加到具有条形码的MicroAmp TM 光学96孔反应板的每个壁中，每个样品重复三次。使用MicroAmp TM 光学粘合剂膜密封平板，并使用MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner在室温下离心平板3分钟。
3. qRT-PCR计划：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：380px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>第1阶段：
  在95°C下预变性30秒
  第二阶段：
  PCR扩增（Reps：40）
  
  95°C 5秒
  
  60°C 34秒
  第3阶段：
  熔化曲线
  
  95°C 15秒
  
  60°C 1分钟
  
  95°C 15秒

数据分析

收集Ct（循环阈值）值并从序列检测软件v1.4.0中导出。将每个样品中标记基因的相对表达相对于内部对照（Endo）标准化，例如持家基因 NbActin 或NbEF1α，并使用下式计算：2 < sup>-ΔCT = 2 - （Ct target - Ct Endo ）计算为ΔOD1- ΔOD2。
＆NBSP;使用下式计算PAMP处理的样品中标记基因与对照处理的样品的相对表达水平：2 -ΔΔCT = 2 - （ΔCT PAMP - ΔCT control ）（图3）。

图3. PTI标记基因的转录水平变化 CYP71D20 XEG1或flg22处理。通过qRT-PCR定量转录水平并归一化至内部对照 NbEF-1α。条形图表示XEG1处理的或flg22处理的叶子相对于对照处理的叶子中的值的平均倍数变化（±S.E.M.），其设定为1。

笔记

使用相似大小的植物很重要。不同植物的叶子应收集在相同大小的相同位置。
应包括阴性对照以测量背景水平。
在渗透过程中应避免PAMP的交叉污染和阴性对照。
对于每个实验，应包括至少三次重复用于统计分析。
不同的PAMP可以在不同的时间点诱导防御相关的标志物基因表达。
qRT-PCR程序适用于Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统。

食谱

1 mM flg22原液
将2.27mg flg22（QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA）（分子量：2272.52）溶解在1ml ddH2 O中，并储存在-20℃。将原料稀释至终浓度200nM
1 mM XEG1原液
将2.73mg XEG1溶于1ml ddH 2 O中，并储存在-20℃。将原料稀释至终浓度200nM
70％乙醇
将30 ml DNase / RNase-free ddH 2 O加入70 ml无水乙醇中

致谢

该协议部分修改自Wang 等人之前发表的论文（2018）。这项工作得到了中国国家科学基金资助王元超创新研究组（批准号31721004）和资金给王燕（批准号31501622和KJQN201663）。

利益争夺

作者声明他们没有利益冲突或竞争利益。

参考 Couto，D。和Zipfel，C。（2016）。植物中模式识别受体信号传导的调控。 Nat Rev Immunol 16（9）：537-552。
Felix，G.，Duran，J.D.，Volko，S。和Boller，T。（1999）。植物对细菌鞭毛蛋白最保守的区域有敏感的感知系统。 Plant J。 18：265-276。
Heese，A.，Hann，D.R.，Gimenez-Ibanez，S.，Jones，A.M。，He，K.，Li，J.，Schroeder，J.I.，Peck，S.C。和Rathjen，J.P。（2007）。受体样激酶SERK3 / BAK1是植物先天免疫的中枢调节因子。 Proc Natl Acad Sci USA 104（29）：12217-12222。
Ma，Z.，Song，T.，Zhu，L.，Ye，W.，Wang，Y.，Shao，Y.，Dong，S.，Zhang，Z.，Dou，D.，Zheng，X。， Tyler，BM和Wang，Y。（2015）。 Phytophthora soja e glycoside hydrolase 12蛋白是一种主要的毒力因子大豆感染并被认为是PAMP。植物细胞 27（7）：2057-2072。
Navarro，L.，Zipfel，C.，Rowland，O.，Keller，I.，Robatzek，S.，Boller，T。和Jones，J。D.（2004）。对flg22的转录天然免疫反应。与Avr基因依赖的防御反应和细菌发病机制的相互作用和重叠。植物生理学 135（2）：1113-1128。
Segonzac，C.，Feike，D.，Gimenez-Ibanez，S.，Hann，D.R.，Zipfel，C。和Rathjen，J.P。（2011）。 Nicotiana benthamiana中病原体相关分子模式诱导反应的层次和作用。植物生理学 156（2）：687-699。
Wang，Y.，Xu，Y.，Sun，Y。，Wang，H.，Qi，J.，Wan，B.，Ye，W.，Lin，Y.，Shao，Y.，Dong，S。， Tyler，BM和Wang，Y。（2018）。富含亮氨酸重复受体的基因筛选显示 Nicotiana RXEG1调节糖苷水解酶12 MAMP检测。 Nat Commun 9（1）：594。
Zipfel，C.，Kunze，G.，Chinchilla，D.，Caniard，A.，Jones，J.D.，Boller，T。和Felix，G。（2006）。通过受体EFR对细菌PAMP EF-Tu的感知限制土壤杆菌中介转换。 Cell 125（4）：749-760。