材料和试剂

无菌一次性手术刀（LABELIANS，Nahita TM ，目录号：SCMEC24）
96孔聚苯乙烯锥形底MicroWell TM 板（Thermo Fisher Scientific，目录号：249570）
15毫升和50毫升锥形离心聚丙烯管（Corning，Falcon ®，产品目录号分别为：352096和352070）
5毫升圆底聚苯乙烯管（Corning，Falcon ®，目录号：352054）
细胞培养60 x 15 mm培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：150288）
1毫升结核菌素注射器（一次性使用25 G x 16 mm）（Terumo，目录号：SS-01T）
BD Micro-Fine + TM 胰岛素注射液0.3 ml; 30 G x 8 mm针（BD，目录号：324826）
70μm细胞过滤器（Corning，Falcon ®，目录号：352350）
柱塞2.5毫升注射器（Terumo，目录号：SS * 02SE1）
皮下注射针（Terumo，目录号：NN-2516R）
非棉质开放巴斯德吸管（150 mm 2 ml）（Hilgenberg，目录号：3150102）
MS色谱柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-201）
6孔聚苯乙烯（PS）multidish（Thermo Fisher Scientific，目录号：140675）
1.2毫升簇管松散（Thermo Fisher Scientific，Abgene ®，目录号：AB-0672）
C57BL / 6J背景上的 Rag2 - / - 小鼠（ B6.129-Rag2 tm1Fwa ）（欧洲小鼠）突变档案[EMMA]）
人重组白细胞介素-33（rIL-3395-270），天然形式（自制;先前在Lefrançais等人，，2014中描述）。
注意：或者，重组IL-33可购自R＆amp; D Systems（R＆amp; D Systems，目录号：3625-IL）。
冰
Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX TM 补充剂，丙酮酸盐）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：31966021）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS，无钙，无镁）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14190169）
RPMI 1640高糖，L-谷氨酰胺，HEPES（ATCC，目录号：30-2001）
青霉素/链霉素100x液体（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：15140122）
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M3148）
重组小鼠IL-2（Cys 160 Ser）蛋白质（R＆amp; D Systems，目录号：1150-ML-020;在含有0.1％牛血清白蛋白的无菌DPBS中以100μg/ ml重构。在-70℃下储存储备液））
IV型胶原酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：17104019）＆nbsp;
DNase I，来自牛胰腺（Roche Diagnostics，目录号：11284932001）＆nbsp;
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10270-106）
正常小鼠血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：10410）
淋巴细胞® -M（CEDARLANE，目录号：CL5035）
EasySep TM 小鼠造血祖细胞分离试剂盒（STEMCELL Technologies，目录号：19856）
CD45 MicroBeads，鼠标（Miltenyi Biotec，目录号：130-052-301）
FACS试剂
注意：必须确定每批试剂的稀释度。
1. 可固化活力染料eFluor 506（稀释度：1 / 1,000）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：65-0866-14）
2. 链霉抗生物素蛋白，PE-Cy TM 7偶联（稀释度：1/100）（BD Pharmingen TM ，目录号：557598）
FACS单克隆抗体
注意：必须确定每批抗体的稀释度。
1. 大鼠抗小鼠CD16 / CD32（小鼠BD Fc Block TM ）（克隆2.4G2，稀释度：1/200）（BD Pharmingen TM ，目录号：553142）
2. 大鼠抗小鼠CD4，FITC缀合（克隆GK1.5，稀释度：1 / 2,000）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：11-0041-85）
3. 大鼠抗小鼠CD3，FITC缀合（克隆17A2，稀释度：1/600）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：11-0032-80）
4. 大鼠抗小鼠CD19，FITC缀合（克隆1D3，稀释度：1 / 2,000）（BD Pharmingen TM ，目录号：553785）
5. 大鼠抗小鼠CD45R / B220，FITC缀合（克隆RA3-6B2，稀释度：1 / 1,000）（BD Pharmingen TM ，目录号：553088）
6. 仓鼠抗小鼠CD11c，FITC缀合（克隆N418，稀释度：1/300）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：11-0114-82）
7. 大鼠抗小鼠CD11b，FITC缀合（克隆M1 / 70，稀释度：1/100）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：11-0112-85）
8. 大鼠抗小鼠Ter119，FITC缀合（克隆Ter119，稀释度：1/100）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：11-5921-85）
9. 大鼠抗小鼠Ly-6G / Ly-6C，FITC缀合（克隆RB6-8C5，稀释度：1/100）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：11-5931-85）
10. 仓鼠抗小鼠FceR1α，FITC缀合（克隆MAR-1，稀释度：1/100）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：11-5898-85）
11. 小鼠抗小鼠NK1.1，FITC缀合（克隆PK136，稀释度：1/300）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：11-5941-85）
12. 大鼠抗小鼠CD45，PerCP缀合（克隆30-F11，稀释度：1 / 1,000）（BD Pharmingen TM ，目录号：557235）
13. 大鼠抗小鼠CD90.2，APC-Cy TM 7缀合（克隆53-2.1，稀释度：1/600）（BD Pharmingen TM ，目录号：561641）
14. 大鼠抗小鼠CD25，缀合的eFluor 450（克隆PC61.5，稀释度：1/300）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：48-0251-82）
15. 大鼠抗小鼠CD127，PE缀合的（克隆A7R34，稀释度：1/100）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：12-1271-83）
16. 大鼠抗小鼠Ly-6A / E（Sca-1），APC缀合（克隆D7，稀释度：1/300）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：17-5981-83 ）
17. 大鼠抗小鼠T1 / ST2（IL-33R），生物素化（克隆DJ8，稀释度：1/100）（MD Biosciences，目录号：101001B）
FACS同种型对照
注意：同种型对照的使用浓度与特异性抗体相同。因此，必须根据匹配抗体的浓度确定稀释度。
肺消化液（见食谱）
1. 大鼠IgG1κ同种型对照，eFluor 450（克隆eBRG1，稀释度：1/300）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：48-4301-80）
2. 大鼠IgG2aκ同种型对照，APC（克隆eBR2a，稀释度：1/300）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：17-4321-81）
3. 大鼠IgG2a，κ同种型对照，PE（克隆eBR2a，稀释度：1/100）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience TM ，目录号：12-4321-82）
4. 大鼠IgG2a，κ同种型对照，APC-Cy TM 7（克隆R35-95，稀释度：1/600）（BD Pharmingen TM ，目录号：552770）
5. 大鼠IgG1，κ同种型对照，生物素（克隆R3-34，稀释度：1/50）（BD Pharmingen TM ，目录号：553923）
PEF缓冲液（见食谱）
PEB缓冲液（见食谱）
ILC2培养基（见食谱）
FACS缓冲液（见食谱）
FACS染色缓冲液（见食谱）

设备

MiniMACS TM 分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-102）
EasySep TM 磁铁（STEMCELL Technologies，目录号：18000）
Malassez血细胞计数器＆nbsp;
水浴
离心机（Eppendorf，型号：5804 R）
4°C冰箱
流式细胞仪（BD，型号：LSR II）

软件

FlowJo软件（Tree Star）
BD FACSDiva TM 软件（BD Biosciences）

程序

注意：为了获得足够的ILC2细胞进行各种实验，我们通常从4或5只小鼠中纯化ILC2。

体内治疗小鼠
1. 如Lefrançais等人所述，制备纯化的人重组IL-33 95-270 。（2014）。人IL-33是小鼠ST2 + 细胞的有效激活剂（Cayrol et al。，2018）。
2. 对于每只小鼠，将4μg人重组IL-33 95-270 腹膜内注射到 Rag2 - / - 小鼠（在DPBS中稀释; V =100μl/小鼠），使用胰岛素注射器（0.3ml; 30G），在第0,1,4,5和6天进行5次（参见图1）。
  
  图1.整个过程的示意图。 Rag2 - / - 小鼠首先用rIL-33 95-270治疗在体内扩展ILC2s （参见程序A）。然后分离Lin - CD45 + ILC2s（参见程序B）并培养数天（参见程序C），然后用于随后的离体或体内实验。＆nbsp;
ILC2隔离
备注：＆nbsp;
1. 淋巴细胞® -M是密度分离介质。使用前将其置于室温至少20分钟，因为淋巴液® -M的密度与温度有关（步骤B2）。
2. 在该过程期间的不同步骤中，将100μl细胞悬浮液收集在96孔板中用于随后的FACS分析。将该板放在冰上，直到步骤B5。
1. 准备肺单细胞悬液
  对于每只鼠标：
  1. 在第7天处死小鼠，取出肺并将其置于装有5ml DMEM的15ml Falcon ®管中。
  2. 新鲜制备肺消化液（每只小鼠2毫升;见食谱）。
  3. 将肺转移到含有500μl肺消化溶液的培养皿中，并使用安装在1ml注射器上的25G针将500μl肺消化溶液平稳地注射到肺叶中。肺必须肿胀（见视频1）
    
    视频1.肺部消化程序。视频显示消化液注入肺部。
  4. 用手术刀将肺切成小块，将压碎的肺转移到Falcon ® 50 ml管中。用1ml肺消化液冲洗培养皿并转移至50ml管中。
  5. 将含有样品的50 ml试管在37°C水浴中孵育1小时。＆nbsp;
  6. 将70μm细胞过滤器放在50ml管上;将样品涂在上面，用2 ml DPBS冲洗用于消化的试管。＆nbsp;
  7. 为了从组织获得均匀的单细胞悬浮液，用2.5ml注射器的柱塞研磨过滤器上的剩余组织，并用另外的2ml DPBS洗涤过滤器。
2. 密度梯度分离富集白细胞种群
  1. 丢弃细胞过滤器并将细胞悬浮液转移到Falcon ® 15 ml管中。
    在室温下以400 x g 离心5分钟。＆nbsp;
  2. 从样品中除去上清液，将细胞沉淀重悬于5ml DPBS中。
  3. 使用巴斯德吸管，在细胞悬浮液下缓慢加入5 ml Lympholyte ® -M（参见图2A）。
  4. 在室温下以1,300 x g 离心20分钟，无需任何制动。＆nbsp;
  5. 对于每个样品，用巴斯德吸管从Lympholyte ® -M / DPBS界面收集目标细胞（参见图2B）。将所有样品合并在一个装有5 ml DPBS的15 ml Falcon ®锥形管中。这一步骤可以恢复淋巴细胞，并消除红细胞，死细胞和碎片。
    
    图2.密度梯度分离程序。 A.离心前，淋巴细胞位于淋巴细胞 -M上方的细胞悬液阶段。 B.离心后，将淋巴样细胞浓缩在DPBS缓冲液和Lympholyte ® -M之间的界面中。管底部有红细胞，死细胞和碎屑。
3. 血统阴性人群的富集
  1. 在4℃下以400 x g 离心5分钟以沉淀细胞。
    注意：在此步骤中在无菌条件下（罩）工作。
  2. 除去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml PEF缓冲液中。
    注意：取100μl细胞悬液用于随后的FACS分析（参见图3A的门控策略和图3B-纯化前）。
  3. 使用血细胞计数器计数细胞。典型的回收细胞数为每只小鼠20×10 6个。
  4. 再次以400 x g 在4℃下离心5分钟。
  5. 继续进行阴性选择：使用EasySep TM 小鼠造血细胞分离试剂盒消耗谱系阳性细胞。该方法使用针对非造血干细胞和非祖细胞（CD5，CD11b，CD19，CD45R / B220，Ly6G / C（Gr-1），TER119）和链霉抗生物素蛋白包被的磁性颗粒的生物素化抗体。按照试剂盒方案，使用EasySep TM 磁体分离未标记的细胞（Lin - ）。在该步骤结束时，将感兴趣的细胞（Lin - ）在15ml管中回收。
  6. 使用含有Lin-ILC2s的负分数，使用EasySep TM 磁体重复耗尽步骤
    注意：取100μl每种细胞部分用于随后的FACS分析（参见图3B-谱系消耗;第一次和第二次消耗）。
4. 选择CD45 + 种群
  1. 在4℃下以400 x g 离心5分钟。
  2. 除去上清液，将细胞沉淀重悬于5ml PEB缓冲液中，用血细胞计数器测定细胞数。典型的回收细胞数为每只小鼠3.7×10 6个。
  3. 继续进行CD45阳性选择：使用与抗小鼠CD45单克隆抗体，MS柱，MiniMACS TM 分离器偶联的磁珠选择CD45 + 细胞，并遵循制造商的建议（Miltenyi Biotech）。在该步骤结束时，回收感兴趣的细胞（Lin - CD45 + ）。
    注意：取100μl细胞悬液用于随后的FACS分析（参见图3B-CD45选择）。＆nbsp;
  4. 在4℃下以400 x g 离心5分钟。
  5. 除去上清液，将细胞沉淀重悬于1ml ILC2培养基中（参见食谱）。
  6. 使用血细胞计数器计数细胞。通常，我们每只小鼠获得1.3×10 6个 ILC2。
5. 继续进行ILC2s染色以进行FACS分析
  1. 用DPBS填充后续分离步骤中含有细胞的96孔板的孔。＆nbsp;
  2. 将板在400℃下离心4℃，离心5分钟，除去上清液。
  3. 进行活力染色：用100μl/孔的Viability Dye-eFluor506重悬细胞沉淀，在DPBS中稀释至1 / 1,000。在4°C孵育30分钟。
  4. 洗涤细胞：用FACS缓冲液完成孔（参见配方），在4℃下以400μL离心平板5分钟并除去上清液。
  5. 将细胞沉淀重悬于50μl/孔的在FACS染色缓冲液（含有Fc块和小鼠血清）中稀释的不同抗体（在材料和试剂＃31-33中列出）中。在4°C孵育30分钟。
  6. 重复洗涤步骤。
  7. 将细胞沉淀重悬于100μlFACS缓冲液中，将每个样品转移至注释的FACS管并加入200μlFACS缓冲液（总体积300μl）。
  8. 继续进行FACS分析（例如在LSR II上）。我们通常获得ILC2群体，其中约90％的细胞表达典型的ILC2s标记物（Lin - CD45 + CD25 + CD90.2 + CD127 + Sca1 + ST2 + ）。
    注意：ILC2分离后的细胞表面标志物分析 - 参见图3C和3D中的一个例子。
    
    图3.小鼠肺ILC2的分离。 A.用于鉴定ILC2的门控策略。首先排除双联细胞和死细胞。 ILC2缺乏谱系标记并表达CD45表面标记。数字表示活细胞中的％。 B.通过FACS在不同步骤分析ILC2纯化：纯化前，谱系+细胞耗尽后和CD45阳性选择后。细胞在活的单细胞上进行门控。数字表示活细胞中的％。 C.分离ILC2后细胞表面标志物的分析（第7天）。细胞在活的单细胞上进行门控。数字表示Lin - CD45 + 细胞中的％。 D.显示了同种型对照。
ILC2文化
ILC2培养的这一步骤导致ILC2数量增加和细胞纯度更高。
1. 稀释细胞悬浮液（来自步骤B4）以获得0.3×10 6个/ ml细胞/ ml。
2. 在6孔板中分配3ml ILC2细胞悬液/孔（第7天）。＆nbsp;
3. 第二天（第8天），在早晨，向每个孔中加入另外3ml ILC2培养基。晚上，将细胞上下移液，分成3个孔，每孔再加3ml培养基（每孔总体积= 5ml）。＆nbsp;
4. 在第11天，通过移液到15ml Falcon ®管中收集细胞，以400 x g 离心5分钟。＆nbsp;
5. 用血细胞计数器计数细胞。 ILC2s可用于离体或体内实验。它们也可以以0.4×10 6 细胞/ ml在培养物中维持长达10天。
  注意：取100μlILC2细胞悬液进行后续FACS分析（见图4）。
6. 如上所述进行FACS分析（步骤B5）。我们通常获得ILC2群（每只小鼠13.6×10 6个细胞），> 1。 95％的细胞表达典型的ILC2s标记（Lin - CD45 + CD25 + CD90.2 + CD127 ^{+ Sca1 + ST2 + ）。
  注意：请参阅图4中的示例 - ILC2分离和培养后的细胞表面标记分析。＆nbsp;
  
  图4.培养4天后（第11天）通过流式细胞术分析ILC2细胞表面标志物。 CD90.2，CD25，Sca-1的代表性直方图，纯化的ILC2表面的CD127和ST2标记。数字表示活细胞中的％。显示同种型对照（灰色直方图）。}

数据分析

使用FACSDiVa TM 软件在LSR II流式细胞仪上获得样品，之前（参见图3）和之后（参见图4）ILC2细胞培养物。使用FlowJo分析流式细胞术数据以对ILC2群体进行门控，定量和分析。

食谱

肺消化液
新鲜制备2ml /含有2mg / ml胶原酶IV和0.1mg / ml DNase I的DMEM样品
PEF缓冲区
含有2％过滤的FBS和1mM EDTA的DPBS
在实验过程中保持无菌和冷，并在4°C下储存
PEB缓冲区
含有0.5％BSA和2mM EDTA的DPBS
在实验过程中保持无菌和冷，并在4°C下储存
ILC2培养基
RPMI-1640培养基补充10％滤过的FBS，1％青霉素/链霉素，50μM2-巯基乙醇和20ng / ml重组小鼠IL-2
准备新鲜，保持无菌，仅在实验期间储存在4°C
FACS缓冲区
含有5％过滤的FBS和5mM EDTA的DPBS
储存在4°C
FACS染色缓冲液
含有5％小鼠血清和1/200抗小鼠CD16 / CD32（Fc阻断）的FACS缓冲液储存在4°C

致谢

该协议改编自我们的出版物（Cayrol et al。，2018）。这项工作得到了法国国家研究部（PS; EM）的Agence Nationale de la Recherche（AD; ANR-12-BSV3-0005-01和ANR-16-CE15-0009-01至J.-PG）的支持，和“基金会ARC”（EM）。我们感谢Girard实验室成员对动物实验的帮助以及FrançoiseViala的图像和视频。我们要感谢ANEXPLO-IPBS设施和成像核心设施TRI-IPBS。我们感谢Nathalie Ortega对动物伦理的帮助。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

根据法国研究部和FRBT（C2EA-01）动物护理委员会（项目00663.02和APAFIS＃3873-2016020116301837v3）批准的方案，根据机构指南处理所有小鼠实验。

参考

Cayrol，C.，Duval，A.，Schmitt，P.，Roga，S.，Camus，M.，Stella，A.，Burlet-Schiltz，O.，Gonzalez-de-Peredo，A。和Girard，JP（ 2018）。环境过敏原通过IL-33的蛋白水解成熟诱导过敏性炎症。 Nat Immunol 19（4）：375-385。
Cayrol，C。和Girard，J.P。（2018）。白细胞介素-33（IL-33）：来自IL-1家族的核细胞因子。 Immunol Rev 281（1）：154-168。
Lefrançais，E.，Duval，A.，Mirey，E.，Roga，S.，Espinosa，E.，Cayrol，C。和Girard，J.P。（2014）。 IL-33的中心结构域被肥大细胞蛋白酶切割，有效激活2组先天性淋巴细胞细胞。 Proc Natl Acad Sci USA 111（43）：15502-15507。
Moro，K.，Ealey，K.N.，Kabata，H。和Koyasu，S。（2015）。小鼠中第2组天然淋巴细胞的分离和分析。 Nat Protoc 10（5）：792-806。