材料和试剂

Amicon Ultra-15离心过滤器MWCO 100 kDa（默克，目录号：UFC910024）
Amicon Ultra-4离心过滤器MWCO 100 kDa（默克，目录号：UFC810024）
BenchMark TM 预染蛋白质梯度（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：10748010）
洗涤剂去除柱（Thermo Fisher Scientific，Pierce TM ，目录号：87779）
乙醇≥95％（Decon Labs，目录号：V1116）
Amphipol A8-35（Anatrace，目录号：A835）
3'，5'-环AMP，cAMP（Alfa Aesar，目录号：J62174-03）
3'，5'-环GMP，cGMP（Sigma-Aldrich，目录号：G6129）
8-NBD-cAMP，f-cAMP（BIOLOG，目录号：N 002）
8-NBD-cGMP，f-cGMP（BIOLOG，目录号：N 001）
戊二醛（Sigma-Aldrich，目录号：G6257）
HEPES（Simga-Aldrich，目录号：H3375）
KCl（Simga-Aldrich，目录号：P9333）
Superdex 200 10/300 GL（GE Healthcare，目录号：17517501）
Amphipol原液（见食谱）
200 mM cAMP储备液（参见食谱）
分析缓冲液（见食谱）

设备

搅拌棒（适用于比色杯）
一套单通道移液器，范围从0.1-1,000μl（VWR，目录号：75788-460）
Äkta色谱系统（GE Healthcare）
NanoDrop TM （赛默飞世尔科技）
荧光分光光度计（HORIBA，PTI QuantaMaster TM ，型号：800）
紫外比色杯（适用于波长在230和800纳米之间，体积根据光谱仪的规格在1到4毫升之间）
冷冻微量离心机（Eppendorf，型号：5418 R）
旋转器（定速旋转器，Cole-Parmer，Stuart，型号：SB2）

软件

可以使用任何能够进行可编程非线性最小二乘拟合的软件分析数据（我们使用GraFit 5分析数据）
GraFit 5.0.13（Erithacus Software Limited， http://www.erithacus.com/grafit/ ）

程序

样品制备和cAMP去除
SthK的表达和纯化细节在Schmidpeter 等（2018）中有详细说明，在下文中我们将仅描述样品制备的详细信息，以便从洗脱样品后开始进行荧光滴定。固定化金属亲和柱。配体去除步骤仅适用于在没有配体的情况下在去污剂中不稳定的蛋白质样品，因此需要在配体存在下进行纯化。＆nbsp;
1. 将蛋白质溶液浓缩至~15 mg / ml（使用Amicon Ultra-15离心过滤器MWCO 100 kDa）并添加额外的cAMP至~400μM。
  注意：确保在此阶段使用cAMP使SthK饱和，因为这有助于蛋白质的稳定性。但是，只有在确定蛋白质浓度后才添加额外的cAMP，因为260 nm处核苷酸的吸光度会影响280 nm处的读数。通过从200mM储备溶液中加入cAMP，稀释液不会显着影响蛋白质浓度（1：1,000稀释）。
2. 简单地旋转聚集体（15,000 x g ，4℃，10分钟）并以A8-35：SthK 3：1（重量/重量）的比例添加amphipol A8-35。
  注意：在使用前，Amphipol应在4℃下在ddH 2 O中水合过夜。 100 mg / ml A8-35的等分试样可以在-20°C下储存，但避免反复冻融。
3. 将蛋白质amphipol混合物在4℃下恒定搅拌（例如缓慢旋转）孵育1小时。
4. 用3倍柱体积的ddH 2 O重力流洗涤洗涤剂去除柱（Pierce TM 洗涤剂去除旋转柱，4 ml），并用3柱体积的缓冲液平衡，不含洗涤剂并降低cAMP浓度（20mM HEPES，100mM KCl，100μMcAMP，pH7.4）。
5. 将1ml SthK：amphipol混合物装入去污剂去除柱中，让溶液完全进入柱床。
6. 向柱中加入4ml缓冲液并立即收集500μl的级分。
7. 通过测量吸光度光谱检查所有馏分的蛋白质含量。
  注意：通过测量350 nm至220 nm的光谱，可以快速区分含蛋白质的部分（280 nm处）和含有cAMP的部分（260 nm处），这些部分将在洗涤剂末端洗脱删除栏。
8. 将含蛋白质的级分合并，并使用Amicon ® Ultra-4浓缩器浓缩至~10 mg / ml，切片浓度为100 kDa。
  注意：即使没有cAMP，SthK在amphipol中也是稳定的。此时，通过在不含cAMP的缓冲液中稀释蛋白质并再次浓缩，可以降低cAMP的浓度。在凝胶过滤之前降低cAMP浓度有助于完全除去配体。
9. 在测定缓冲液中的Superdex200（10/300）色谱柱上加载SthK in amphipol，并使用Äkta系统（GE Healthcare）进行凝胶过滤（图2A）。
  注意：有关尺寸排阻色谱以及实际方面的详细信息， GE Healthcare Life Sciences的手册是一个很好的资源。
10. 收集含有四聚体SthK的峰（图2A和2B），并使用具有100kDa截止值的Amicon ® Ultra-4浓缩器浓缩至~400μM。
11. 使用蛋白质的消光系数从吸收光谱确定最终蛋白质浓度（对于SthK，消光系数是ε 280 = 55,900 M -1 cm - 1 ）。
  注意：吸光度比A 260 / A 280 可用于评估cAMP去除的效率。通常，对于没有cAMP的SthK，我们的值达到0.5。
  
  图2.用Amphol中SthK的8-NBD-cAMP的样品制备和滴定。 A.在amphipol交换后SthK的凝胶过滤曲线（Superdex200 10/300在20 mM HEPES中，100 mM KCl，pH 7.4）去除cAMP。 B.使用0.13％戊二醛（Kapoor，2015）在Amphipol A8-35中交联SthK的SDS-PAGE（在37℃下5分钟）显示来自凝胶过滤的主峰是四聚体SthK。将所有样品加热至98℃10分钟，然后根据制造商的说明书进行SDS-PAGE。选择分子量标准的选定条带（MW，BenchMark TM Pre-stained Protein Ladder，Thermo Fisher Scientific）。 C.在8-NBD-cAMP和SthK（上图）之间进行单次滴定实验的实例，其具有平均荧光值（圆圈）和根据等式6（线）的拟合，通过8-NBD-cAMP的荧光在没有的情况下校正of SthK（ K D ＆nbsp; =0.72μM）。拟合和数据点之间的残差（下图）证明了拟合的良好性。＆nbsp;
用SthK滴定荧光环核苷酸
1. 通过将amphipol中的SthK与f-cAMP或f-cGMP和测定缓冲液混合以制备用于滴定的SthK储备溶液以达到所需浓度（浓度可根据表1容易地调整）。
  注意：对于每次荧光滴定，产生信号的分子应在整个实验过程中保持恒定浓度，以避免由于浓度变化引起的信号变化。因此，应将f-cAMP或f-cGMP添加到最终浓度的滴定品中（参见步骤B6）。＆nbsp;
2. 打开荧光光谱仪并等待至少20分钟，以使灯泡达到稳定的温度，并将激发波长设置为463 nm，发射波长为536 nm，每个波长为5 nm。
  注意：带宽设置很大程度上取决于荧光计。如果在实验期间观察到荧光漂白，则可以减少激发带宽。如果记录的信号强度较低，则可以增加发射带宽。
3. 用ddH 2 O，2 x 70％乙醇和2 x ddH 2 O洗涤紫外线相容的比色杯2次，用加压空气快速干燥，放干净在比色杯内搅拌棒，将比色皿放入荧光计中。
4. 向比色杯中加入1,999.8μl测定缓冲液，并将搅拌棒的速度调节至中等。
  注意：在整个实验过程中不断搅拌溶液可确定组分的均匀平衡，并通过降低局部荧光漂白的影响来提高信号稳定性。
5. 平衡缓冲液2分钟，在463nm激发后测量536nm处的荧光。
  注意：有两种主要的荧光测量模式。一些仪器读取一定数量的点并平均荧光。确保将值设置为至少5次测量。另一种可能性是随时间监测荧光并在至少1分钟内手动平均。
6. 将0.2μlf-cAMP或f-cGMP从1 mM储备溶液中加入比色杯中并平衡2 min，然后测量荧光（0μMSthK值）。
  注意：在我们的案例中，使用0.1μM荧光cNMP证明是一个很好的信号。可以根据光谱仪的灵敏度和正在分析的相互作用的K D 值来调整浓度。
7. 将2μlSthK/ f-cAMP或SthK / f-cGMP储备溶液加入比色皿中（根据表1），平衡2分钟并测量荧光。
8. 使用移液方案定义的体积重复步骤B7（参见表1中的示例）。
  注意：每次从储备溶液中添加SthK时均衡2分钟，以确保复合物形成达到稳定的平衡状态。
  
  表1.0.1μMf-cAMP移液方案示例和SthK浓度增加
  
  表1提供了如何设置电子表格以轻松调整滴定实验的体积和浓度的示例。储备溶液中相互作用分子的体积和浓度在第一栏中给出。比色皿中的最终体积（第3列）和最终的SthK浓度（第4列）应计算为原料浓度和添加体积（分别为第1列和第2列）的函数，以便能够轻松调整实验。通过改变储备溶液中的滴定剂浓度和每个步骤中将添加到比色皿中的体积，可以在整个滴定过程中跨越宽范围的浓度。
标记的cAMP和未标记的cNMP之间的竞争测定
1. 根据您的移液方案准备SthK在amphipol，f-cAMP和cNMP中的储备溶液（表2）。
  注意：f-cAMP和SthK的浓度是固定的，cNMP（滴定剂/竞争剂）的浓度较高。这确保了在整个实验过程中提供读数的组分浓度（SthK和f-cAMP之间的复合物）是恒定的。
2. 打开荧光光谱仪并等待至少20分钟，以使灯泡达到稳定的温度，并将激发波长设置为463 nm，发射波长为536 nm，每个波长为5 nm。
  注意：带宽设置很大程度上取决于荧光计。如果在实验期间观察到荧光漂白，则可以减少激发带宽。如果记录的信号强度较低，则可以增加发射带宽。
3. 用ddH 2 O，2 x 70％乙醇和2 x ddH 2 O洗涤紫外线相容的比色杯2次，用加压空气快速干燥，放干净在比色杯内搅拌棒，将比色皿放入荧光计中。
4. 将测定缓冲液添加到比色皿中并将搅拌棒的速度调节至中等。从缓冲液体积中省略f-cAMP和SthK的体积，以便在第一个数据点达到2,000μl（参见步骤C5和C6）。
5. 向比色杯中加入0.3μMf-cAMP，平衡2分钟并测量荧光（这用作对照测量）。
6. 向比色杯中加入0.3μMSthK，平衡2分钟并测量荧光（这是0μMcNMP值）。
7. 在测量荧光之前，将1μl储备溶液（由表2中的移液方案定义）加入比色杯中并平衡2分钟。
8. 使用移液方案定义的体积重复步骤C7（表2，第2列）。
  注意：每次从储备溶液中添加SthK时均衡2分钟，以确保复合物形成达到稳定的平衡状态。
  
  表2. cNMP与0.3μMf-cAMP和0.3μMSthK之间形成的复合物竞争的移液方案示例
  
  表2提供了如何设置电子表格以轻松调整竞争实验的体积和浓度的示例。储备溶液中相互作用分子的体积和浓度在第一栏中给出。比色皿中的最终体积（第3列）和cNMP的最终浓度（第4列）应计算为原料浓度和添加体积（分别为第1列和第2列）的函数，以便能够轻松调整实验。通过改变储备溶液中的竞争剂浓度（cNMP）和每个步骤中将添加到比色皿中的体积，可以在整个竞争实验中跨越各种浓度。

数据分析

在我们的例子中，我们以1秒的间隔记录每个SthK浓度的荧光1分钟，并将信号输出为文本文件。将数据导入Excel，手动平均，然后将平均值绘制为GraFit中配体浓度的函数（用荧光环核苷酸滴定的SthK或用于竞争测定的未标记的环核苷酸）（图2C，Schmidpeter 等人，2018）。分别对每个单独的滴定和竞争实验进行分析，将得到的 K D 值取平均值并计算平均值的标准误差（SEM）。对于每种条件，对不同的蛋白质纯化进行至少三次独立实验（Schmidpeter 等，，2018）。

滴定实验分析
根据直接定义解离常数 K D 的两态模型（方程1）分析荧光环核苷酸与SthK的滴定（方程式2）。 br />
[SthK] + [cNMP]⇄[SthK∙cNMP]＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;式。 1
K D =（[SthK]∙[cNMP]）/ [SthK∙cNMP]＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;等式2

[SthK]是游离SthK单体的浓度，[cNMP]是游离环核苷酸的浓度，[SthK∙cNMP]所得复合物的浓度和 K D 解离常数。

考虑到质量守恒，自由浓度可以表示为总浓度和复合物浓度的函数（例如，[SthK] = [SthK] 0 - [ SthK∙cNMP]）。可以将等式2重写为等式3，得到描述复数形成的二次方程（等式4）。

（[SthK] 0＆nbsp; - [SthK∙cNMP]）∙（[cNMP] 0 - [SthK∙cNMP]）= K D＆nbsp; ∙[SthK∙cNMP]＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;等式3
[SthK∙cNMP] 2＆nbsp; - （[SthK] 0＆nbsp; + [cNMP] 0＆nbsp; + K D ）∙[SthK∙cNMP] + [SthK] 0＆nbsp; ∙[cNMP] 0＆nbsp; = 0＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;式。 4

求解二次方程得到公式5.

[SthK∙cNMP] =（（[SthK] 0＆nbsp; + [cNMP] 0＆nbsp; + K D ）-√（（[SthK] 0＆nbsp; + [cNMP] 0＆nbsp; + K D ）^{2＆nbsp; - 4∙[SthK] 0＆nbsp; ∙[cNMP] 0 ））/ 2＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;等式5

由于荧光cNMP的浓度在整个实验方程中是恒定的，因此可以将[5]除以[cNMP] 0 。该等式现在描述了作为[SthK] 0 的函数的结合cNMP的分数。此外，我们假设cNMP与SthK相互作用时的荧光增加描述了复合物的形成，导致最终的方程分析结合数据（方程式6，图2C）。

F（[SthK]）= F min＆nbsp; +（F max＆nbsp; - F min ）∙（（[SthK] 0＆nbsp ; + [cNMP] 0＆nbsp; + K D ） - √（（[SthK] 0＆nbsp; + [cNMP] 0＆nbsp; + K D ） 2＆nbsp; - 4∙[SthK] _{0＆nbsp; ∙[cNMP] 0 ））/（2∙[cNMP] 0 ）＆nbsp; ＆NBSP;式。 6

F min 和F max 分别为最小和最大荧光（即，单独[cNMP] 0的荧光和[cNMP] ] 0用SthK饱和。
测量的荧光值可以使用F min 和F max 进行归一化，如此拟合程序所确定，然后根据之前的假设描述结合的cNMP的分数。 />}}
竞争实验分析
从竞争实验获得的数据的分析更复杂，因为两个配体根据等式7竞争一个结合位点并且之前已经描述过（Wang，1995; Wilkinson，2004; Cukkemane et al。， 2007）。

[SthK∙fcAMP] + [cNMP]⇆[SthK] + [fcAMP] + [cNMP]⇄[SthK∙cNMP] + [fcAMP]＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;等式7

其中[SthK]，[fcAMP]和[cNMP]分别表示游离SthK，8-NBD-cAMP和cNMP（cAMP或cGMP）的浓度。 [SthK∙fcAMP]和[SthK∙cNMP]描述了SthK和8-NBD-cAMP或SthK和cNMP之间的两种可能的复合物。

因此，可以确定两个解离常数， K a 用于SthK和8-NBD-cAMP之间的复合物（方程式8）和 K < sub> b 表示SthK和cNMP之间的复合物（公式9）。

K a＆nbsp; =（[SthK]∙[fcAMP]）/ [SthK∙fcAMP]＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;等式8
K b＆nbsp; =（[SthK]∙[cNMP]）/ [SthK∙cNMP]＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;等式9

类似于滴定实验并考虑质量守恒方程式7-9可以组合成三次方程（方程式10）。

[SthK] 3＆nbsp; + a∙[SthK] 2＆nbsp; + b∙[SthK] + c = 0＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;式。 10
a，b和c由公式11-13定义。

a = K a＆nbsp; + K b＆nbsp; + [fcAMP] 0＆nbsp; + [cNMP] 0＆nbsp; - [SthK] 0 ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;式。 11
b = K b＆nbsp; ∙（[fcAMP] 0＆nbsp; - [SthK] 0 ）+ K a＆nbsp; ∙（[cNMP] 0＆nbsp; - [SthK] 0 ）+ K a＆nbsp; ∙ K b ＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;等式12
c = - K a＆nbsp; ∙ K b＆nbsp; ∙[SthK] 0 ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;等式13

其中[fcAMP] 0 ，[cNMP] 0 和[SthK] 0 表示每种化合物的总浓度。

立方函数对于指定的问题只有一个有意义的解决方案，并且可以在Wang（1995）中找到详细的分析推导，并在Wilkinson（2004）中进行更具描述性的解释。同样，观察到的信号变化与SthK和8-NBD-cAMP之间的复合物形成有关，并且可以根据等式14分析来自竞争实验的数据。

F = F min＆nbsp; +（F max＆nbsp; - F min ）∙（2∙√（（a 2＆nbsp; - 3b））∙ cos （θ/ 3） - a）/（3∙ K a＆nbsp; + [2∙√（（a 2＆nbsp; - 3b））∙ cos （θ/ 3） - a]）＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;式。 14
用公式15中定义的θ
θ= arccos＆nbsp; ∙（-2a 3＆nbsp; + 9ab - 27c）/（2∙√（（a 2＆nbsp; - 3b）< sup> 3 ））＆nbsp; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP; ＆NBSP;式。 15

注意：此分析可以计算 K a 和 K b 同时进行。然而，在直接结合测定中测定的f-cAMP的解离常数也可以在拟合过程中设定为恒定，以减少游离参数的数量。

笔记

通常，两种测定，荧光配体的直接结合和两种配体之间的竞争都是非常稳健的。根据我们的经验，最大的变异性来自凝胶过滤后结合的cAMP的含量，其由蛋白质样品的最终A 260 / A 280 比率确定。

食谱

Amphipol股票解决方案
在ddH 2 O中100 mg / ml A8-35（在4°C下水合过夜）
200 mM cAMP储备溶液＆nbsp;
1. 将0.66g cAMP溶解在9.5ml ddH 2 O中
2. 将pH调节至7.4，填充至10 ml并通过测量260 nm处的吸光度来检查储备溶液的确切浓度（cAMP的消光系数为ε 260 14600 M -1 < / sup> cm -1 ）
3. 将cAMP储备溶液以200μl等分试样储存在-20°C
分析缓冲区
20mM HEPES，100mM KCl，pH 7.4，无菌过滤（0.22μm）

致谢

该方案的工作部分由美国国立卫生研究院（R01GM124451和R01GM088352）和CN和Deutsche Forschungsgemeinschaft（SCHM3198 / 1-1）和美国心脏协会（18POST33960309）资助。 Cukkemane 等人（2007）之前已经进行了类似的研究，Wilkinson（2004）对该分析进行了总结。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

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