材料和试剂

200μl移液器吸头（Greiner Bio-one，目录号：741065）
1000μl移液器吸头（Greiner Bio-one，目录号：741045）
15毫升锥形管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
2毫升螺旋盖管（SARSTEDT，目录号：72.693.105）
0.5毫米玻璃珠（Carl Roth，目录号：N030.1）
11.3 x 7.7 cm Bio-Dot / Bio-Dot SF滤纸（Bio-Rad Laboratories，目录号：1620161）
醋酸纤维素膜，0.22微米，Sphaero（Sterlitech，目录号：CA023001）
1.5 ml微量离心管（Greiner Bio One International，目录号：616201）
橡胶密封圈
保鲜膜
50毫升锥形管（SARSTEDT，目录号：62.547.004）
蠕虫
Pierce TM BCA蛋白质分析试剂盒（赛默飞世尔科技，目录号：23227）
完整的蛋白酶抑制剂（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）
ECL TM Prime Western Blotting Detection（GE Healthcare，Amersham，目录号：RPN2232）
液氮
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
1M Tris-HCl
5 M NaCl
10％SDS
Milli-Q水
脱脂奶粉（Campina）
抗绿色荧光蛋白（GFP）/黄色荧光蛋白（YFP）和微管蛋白（表1）的抗体

表1.一抗和二抗列表
bordercolor =“＃000000”style =“width：800px;” border =“1”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>一抗主持人
公司/目录编号
稀释一抗
二抗
α-GFP
老鼠

TaKaRa Bio，＆nbsp;
Clontech Laboratories（632381）
1：5,000

反鼠标（1：10,000）
Bio-Rad（1706516）
α-微管蛋白
老鼠
Sigma-Aldrich（T6074）
1：5,000
反鼠标（1：10,000）
Bio-Rad（1706516）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4 •7H 2 O）（Acros Organics，目录号：424380010）
氯化钠（NaCl）（默克，目录号：1064041000）
氯化钾（KCl）（Fisher Chemicals，目录号：10010310）
10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
1x PBS-Triton 0.1％（见食谱）
1x PBS-Triton 0.05％（见食谱）
过滤器捕获分析（FTA）样品缓冲液（参见食谱）
FTA洗涤缓冲液（见食谱）
1 M二硫苏糖醇（DTT，见食谱）
阻塞解决方案（见食谱）

设备

P20 Pipetman（吉尔森，产品目录号：F123600）
P200 Pipetman（吉尔森，产品目录号：F123601）
P1000 Pipetman（吉尔森，产品目录号：F123602）
30-300μl多通道移液器（Eppendorf，目录号：3125000052）
10 ml血清玻璃移液器（SARSTEDT，目录号：86.1254.001）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：SL 40R，转子：TX-750）
珠子打浆机（MP Biomedicals，型号：FastPrep-24）
48孔Bio-Dot微滤系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703938）
真空泵＆nbsp;
20°C培养箱（LIEBHERR，型号：WK 4126）
Vortex（Fisher scientific，型号：ZX Wizard vortex，目录号：11746744）
富士Super RX-N 13x18胶片（Fujifilm，目录号：RX1318）
高压灭菌器

软件

ImageJ（开源： https://imagej.nih.gov/ij/ ）
Microsoft Excel（Microsoft Corporation，Redmond，USA）

程序

样品制备
1. 准备10-15个平板，每9厘米NGM平板具有大约800-1,000个同步L4蠕虫。
2. 使用10 ml血清玻璃移液管从含有8-10 ml 1x PBS的平板上清洗蠕虫，并将蠕虫收集到15 ml锥形管中。
3. 在室温下以1,000 x g 离心蠕虫2分钟。丢弃上清液，不要打扰蠕虫颗粒。
4. 重复步骤A2（用1x PBS洗涤）共三次或直至上清液澄清。去除上清液，留下1.5-2.0毫升（或足够的体积覆盖蠕虫沉淀）。
5. 通过用0.05％Triton X-100“上下”移液PBS预湿P1000蓝色尖端。这有助于减少粘在塑料尖端壁上的蠕虫。
6. 使用这个P1000蓝色尖端并将蠕虫转移到一个2毫升螺旋盖管中，并在1,000 x g 下短暂离心2分钟以沉淀蠕虫。丢弃上清液。
7. 用冷的500μlFTA洗涤缓冲液清洗一次蠕虫。
8. 将冷的FTA样品缓冲液以1：1的比例添加到蠕虫颗粒中（例如，10-15个板产生约250μl的蠕虫颗粒）。
9. 按体积比2：1加入0.5毫米玻璃珠。
10. 珠子以4米/秒的速度击打样品进行7个20秒的循环，在循环之间休息5分钟。尽可能将样品保存在冰上。
  注意：该方案在室温下使用珠磨机进行。因此，重要的是尽可能将样品保持在冰上（例如，在5分钟的休息周期之间）。
11. 将上清液转移到1.5 ml微量离心管中。
  安全停止点：在液氮中快速冷冻样品并储存在-80°C直至进一步使用。
12. 使用Pierce TM BCA蛋白质分析试剂盒测量蛋白质浓度。
  注意：对于10-15个同步L4蠕虫板，我们发现蛋白质产量在2-5 mg / ml之间变化。这种可变性将取决于诸如通过漂白的蠕虫同步效率（因此每个板开始的蠕虫数量），蠕虫从板上洗掉并转移到微量离心管等的因素等等。
13. 将100μg总蛋白转移至1.5 ml微量离心管中，并加入冷FTA样品缓冲液至终体积400μl（终浓度100μg/400μl）。对于上样对照，取10μg或12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分别运行1-5μg样品。
14. 加入20μl1M DTT。
15. 将样品在98℃下煮沸5分钟。
16. 在新的1.5 ml微量离心管中为每个样品准备两种稀释液：
建立Bio-Dot微滤系统
1. 将两片11.3×7.7厘米Bio-Dot / Bio-Dot SF滤纸和一片醋酸纤维素膜（切成相似大小）浸泡在约25毫升FTA洗涤缓冲液中。
2. 将它们放在Bio-Dot微滤系统的底座上，在滤纸上放置醋酸纤维素膜。
3. 使用玻璃移液管将任何气泡滚出。
4. 将橡胶密封圈和盖子放在Bio-Dot微滤系统上，对角插入并拧紧所有四个螺钉，使压力均匀分布（图1）。
  
  图1. Bio-Dot微滤系统，带有橡胶密封和斜向拧紧螺钉
5. 施加真空并进一步拧紧螺钉。关掉真空。
6. 使用多通道移液器，用100μlFTA洗涤缓冲液清洗Bio-Dot微滤系统的每个孔，并施加完全真空直至孔为空。
7. 重复此步骤共三次。
8. 关闭真空吸尘器时，将T形连接器旋转180°并在其上放置P1000蓝色吸头以施加低真空（图2）。
  
  图2.如何将Bio-Dot微滤系统设置为低真空的示意图
9. 将100μl未稀释的，5倍和25倍稀释的样品加载到相邻的孔中，同时将移液管尖端放置到孔的侧面以避免气泡。
10. 施加低真空直至孔为空（应该需要约2至3分钟）。
11. 用100μlFTA洗涤缓冲液洗涤孔三次。
12. 拆除设备并用去离子水适当清洁。
醋酸纤维素膜上蛋白质聚集体的免疫检测
1. 每膜施加15ml封闭溶液（5％牛奶，1x PBS-Triton 0.1％），并在室温下孵育30分钟。
2. 除去封闭溶液，然后在封闭溶液中稀释15ml一抗（参见表1进行稀释）。在4°C孵育过夜。
3. 在PBS-Triton 0.1％中洗涤膜三次，每次5分钟。
4. 施用15ml在封闭溶液中稀释的二抗（参见表1）并在室温下孵育1小时。
5. 在PBS-Triton 0.1％中洗涤膜三次，每次5分钟。
6. 将膜置于塑料包装中，每膜施加1ml ECL TM Prime Western Blotting Detection Reagent。孵育1分钟。
7. 去除多余的液体和气泡并发展。

数据分析

在Sin 等人。（2017），对表达与YFP融合的40个谷氨酰胺（Q）重复的蠕虫（此处称为Q40蠕虫）进行前向遗传筛选，以寻找具有减少的多聚谷氨酰胺聚集体数量的突变体（Sin et al。，2017）（图3A）。该研究鉴定了RNA聚合酶III转录的调节因子 - moag-2 / lir-3 - 作为聚集促进因子。该基因的失活（通过点突变或缺失等位基因）减少了聚谷氨酰胺的聚集（图3）。
＆NBSP;应该进行至少三次独立实验，并且可以使用等量蛋白质加载对照的替代选择（例如，肌动蛋白）。如果使用荧光报告基因监测蛋白质聚集（例如，GFP，mCherry），应该量化其表达水平以排除观察到的效应是由于报告基因表达水平的变化的可能性。基因。
＆NBSP;使用ImageJ通过光密度测定法定量免疫印迹。数据分析的一个例子可以在Sin et al。（2017）的图1F和S1E中找到。为了量化SDS不溶性蛋白质的相对量，通过除以Q40的值计算比率（倍数变化）; moag-2 / lir-3 突变体（未点稀释的点突变等位基因样品 pk2183 和缺失等位基因 tm813 如图3B所示，顶部）通过它们相应的野生型（ wt ，先前标准化为α-微管蛋白作为上样对照）。在该研究中，包括Q40-YFP和α-微管蛋白表达作为对照（图3B，底部）。 https://imagej.nih.gov/ij也提供了更详细的教程。 /docs/menus/analyze.html （在“Gels Submenu”下）和 http://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-image-j/ 。

图3.使用来自Q40蠕虫和Q40的粗蛋白裂解物的5倍和25倍稀释的滤膜延迟测定; moag-2 / lir-3 突变体蠕虫（点突变等位基因 pk2183 和删除等位基因 tm813 ）。 A. Q40蠕虫（菌株AM141）的代表性图像和Q40; moag-2 / lir-3（pk2183）蠕虫（Sin et al。，2017）。比例尺=75μm。 B.最重要的是，用α-GFP抗体探测以检测聚谷氨酰胺聚集体的代表性免疫印迹。在底部，通过用α-GFP（对照YFP表达）和α-微管蛋白（对等蛋白质加载对照）抗体探测的蠕虫裂解物的标准Western免疫印迹分析显示输入对照。 C.使用ImageJ通过光密度测定法定量滤光片延迟测定。表示三个生物学重复的平均值。数据表示为平均值±SEM，并且使用单尾未配对的学生 t - 测试计算显着性。 * P ＆lt; 0.05。更多的实验细节可以在Sin 等人（2017）中找到。

食谱

10x PBS（1升）
1. 混合25.6g Na 2 HPO 4 ·7H 2 O，80g NaCl，2g KCl，2g KH 2 PO <子> 4
2. 用蒸馏水加1升
3. 在121℃下高压灭菌20分钟
4. 将10x PBS保持在室温下
5. 用蒸馏水稀释至1倍，并将pH调节至7.0以获得工作溶液
6. 1x PBS可以保持在室温下＆nbsp;
含有0.1％Triton X-100（10 ml）的1x PBS
将1ml Triton X-100加入10ml 1x PBS中并混合
含有0.05％Triton X-100（10 ml）的1x PBS
将500μlTritonX-100加入10ml 1x PBS中并混合
过滤器捕集分析（FTA）样品缓冲液（50 ml，使用前新鲜）
1. 添加所有组件：
  500μl1MTris-HCl pH 8.0（终浓度：10mM）
  1.5毫升5 M NaCl（终浓度：150 mM）
  10毫升10％SDS（终浓度：2％）
  添加完全蛋白酶抑制剂（每10毫升1片）
2. 用Milli-Q水补充至50毫升
过滤器捕集分析（FTA）洗涤缓冲液（50 ml，使用前新鲜）
1. 添加所有组件：
  500μl1MTris-HCl pH 8.0（终浓度：10mM）
  1.5毫升5 M NaCl（终浓度：150 mM）
  500μl10％SDS（终浓度：0.1％）
  添加完全蛋白酶抑制剂（每10毫升1片）
2. 用Milli-Q水补充至50毫升
1 M二硫苏糖醇（DTT）（10 ml）
1. 将1.5克DTT（MW = 154.25）溶于8毫升去离子水或蒸馏水中
2. 将体积调节至10毫升，制成1毫升等分试样
3. 储存在-20°C（长期保存）
封闭溶液（5％牛奶，1x PBS-Triton 0.1％）（50 ml，使用前新鲜）
1. 称取2.5 g无脂奶粉放入50 ml锥形管中，加入50 ml PBS-Triton 0.1％
2. 涡旋混合彻底

致谢

我们感谢Caenorhabditis遗传学中心（由美国国立卫生研究院国家研究资源中心资助）和Mitani实验室的 C.线虫菌株（由日本国家生物资源项目资助）。该项目由欧洲研究理事会（ERC）资助（EAAN），FundaçãoparaaCiênciaeTecnologia奖学金（SFRH / BPD / 51009/2010）（OS），Ubbo推动的校友章节Gooische Groningers资助。 Emmius Fonds（致EAAN）和格罗宁根大学药物探索研究所（GUIDE）奖学金（OS）。该方案改编自Scherzinger 等人（1997）和Wanker 等人发表的程序。（1999）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Bieschke，J.，Cohen，E.，Murray，A.，Dillin，A。和Kelly，J。W.（2009）。 C的动力学评估。线虫淀粉样蛋白解聚活性能够解除分解和蛋白质水解。 Protein Sci 18（11）：2231-2241。
Kuiper，E.F.，de Mattos，E.P.，Jardim，L.B.，Kampinga，H.H。和Bergink，S。（2017）。聚谷氨酰胺聚集中的分子伴侣：超越Q-Stretch。 Front Neurosci 11：145。＆nbsp;
Recasens，A.，Carballo-Carbajal，I.，Parent，A.，Bove，J.，Gelpi，E.，Tolosa，E。和Vila，M。（2018）。帕金森病患者外周α-突触核蛋白聚集体缺乏致病潜力。 Acta Neuropathol Commun 6（1）：8。＆nbsp;
Scherzinger，E.，Lurz，R.，Turmaine，M.，Mangiarini，L.，Hollenbach，B.，Hasenbank，R.，Bates，G.P.，Davies，S.W.，Lehrach，H。和Wanker，E.E。（1997）。亨廷顿编码的聚谷氨酰胺扩增形成淀粉样蛋白聚集体体外和 in vivo 。 Cell 90（3）：549-558。＆nbsp;
Sin，O.，de Jong，T.，Mata-Cabana，A.，Kudron，M.，Zaini，MA，Aprile，FA，Seinstra，RI，Stroo，E.，Prins，RW，Martineau，CN，Wang， HH，Hogewerf，W.，Steinhof，A.，Wanker，EE，Vendruscolo，M.，Calkhoven，CF，Reinke，V.，Guryev，V。和Nollen，EA（2017）。鉴定与疾病相关蛋白聚集相关的RNA聚合酶III调节因子。 Mol Cell 65（6）：1096-1108 e1096。＆nbsp;
索托，C。（2003）。展开蛋白质错误折叠在神经退行性疾病中的作用。 Nat Rev Neurosci 4（1）：49-60。＆nbsp;
Stroo，E.，Koopman，M.，Nollen，E。A.和Mata-Cabana，A。（2017）。老化和疾病中淀粉样蛋白形成的细胞调节。 Front Neurosci 11：64。＆nbsp;
Wanker，E.E.，Scherzinger，E.，Heiser，V.，Sittler，A.，Eickhoff，H。和Lehrach，H。（1999）。用于检测含淀粉样蛋白聚谷氨酰胺的蛋白质聚集体的膜过滤检测。方法Enzymol 309：375-386。