材料和试剂

移液器吸头
解剖刀
滤纸（Whatman滤镜）（1号）
0.22μmMillex-GV滤波器（默克，产品目录号：SLGP033NS）
Amicon Ultra-15离心过滤装置3KD（默克，产品目录号：UFC900308）
P上。 sojae >菌株（P6497）
V8果汁（ https://www.campbells.com/v8/vegetable-juice/）
碳酸钙（CaCO 3 ）（Sigma-Aldrich，目录号：398101）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（默克，目录号：1048730250）
酵母提取物（Sigma-Aldrich，目录号：Y1625-1KG）
硫酸镁七水合物（MgSO 4 •7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：RES0089M-A702X）
D-葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G8270-100G）
L-天冬酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：A0884-100G）
β-谷甾醇（Sigma-Aldrich，目录号：S1270-10MG）
硫胺素（VB1）（西格玛奥德里奇，目录号：T4625-5G）
Milli-Q-fi过滤H 2 O.
硫酸铵（NH 4 ） 2 SO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：A4418-100G）
三氨基甲烷（Tris-HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：154563-1KG）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：80849-10MG）
30％丙烯酰胺
10％十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L3771-100G）
10％过硫酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A3678-25G）
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：T9281-25ML）
考马斯亮蓝（CBB-R-250）（Beyotime Biotechnology，目录号：P0017）
乙醇（ALADDIN-E，目录号：A112719）
乙酸（ALADDIN-E，目录号：A116174）
甲醇（ALADDIN-E，目录号：M116127）
含2％琼脂的V8果汁（见食谱）
合成液介质（见食谱）
TE缓冲区（见食谱）
SDS-PAGE凝胶（见食谱）
R-250染色液（见食谱）
Destaining解决方案（见食谱）

设备

移液器
锥形瓶（1升）
烧杯（5升）
量筒（1 L）
恒温培养箱（CTI）（25°C）
恒温振动器（CTS）（25°C，100 rpm）
离心机＆NBSP;
液相色谱仪（GE Healthcare，型号：ÄKTAavant25）
Sephadex G-25S柱（GE Healthcare，目录号：17140801）
色谱柱（GE Healthcare，型号：Superdex TM 200增加，目录号：28990944）

注意：未提供公司和产品目录号的材料，试剂和设备可以从任何合格的公司订购，以便在本实验中使用。>

程序

P的制备和培养。 sojae >用于分泌蛋白质
1. P上。将Sojae >菌株P6497在灭菌的10％V8果汁中与含有2％琼脂培养基的25℃在恒温培养箱（CTI）中在黑暗条件下培养4天（图1）。
  
  图1. P.大豆 > 菌落在V8培养基上生长4天
2. 对于分泌蛋白质的产生，切割 P. sojae >在V8平板上生长成3毫米x 3毫米的圆盘，带有无菌手术刀。转移20个 P.将sojae >圆盘放入1L合成液培养基中，在恒温振荡器（CTS）（25°C，100 rpm）上孵育10天（图2）。
  
  图2. P.大豆> 在合成液体培养基中培养10天
P从培养基中提取和收集分泌蛋白。 sojae
>
1. 收集 P. sojae >培养液，在1,200 x g >离心20分钟，过滤两层Whatman滤器（1号），然后过滤0.22μmMillex-GV滤器。＆nbsp;
2. 每100ml滤液加入70g（NH 4 ） 2 SO 4 进行沉淀，并在4℃下孵育12小时。
3. 将沉淀溶解在4ml TE缓冲液中。
色谱纯化和 P分泌的提取物的分离。 sojae >（见视频1）
1. 凝胶过滤脱盐色谱分离沉淀的蛋白质
  1. 使用TE缓冲液平衡Sephadex G-25S，结合材料和洗脱系统。
  2. 将蛋白质样品加载到Sephadex G-25S柱中。
  3. 分别收集对应于每个吸光度峰的级分，并使用3-kD分子量离心过滤装置浓缩。（吸收峰代表AKTA屏幕上的UV280线，图3）
2. 凝胶过滤筛分色谱
  1. 收集Sephadex G-25S洗脱的样品，随后注入TE缓冲液平衡的Superdex TM 200增量色谱柱。＆nbsp;
  2. 分别收集对应于每个吸光度峰的级分，然后使用3-kD分子量离心过滤装置进行脱盐和浓缩（参见Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit 3-kD手册）。
3. 对应于每个吸光度峰的级分的SDS-PAGE分析
  1. 将浓缩的蛋白质（20μl约100μg/ ml）加载到10％SDS-PAGE凝胶中，并在100V下电泳1小时。＆nbsp;
  2. 用考马斯亮蓝染色凝胶过夜，然后在室温下脱色3小时。
4. SDS-PAGE凝胶中蛋白质的分离和洗脱
  1. 对于在SDS-PAGE凝胶中进行考马斯亮蓝染色后显示多于一个条带的级分（图3），将每个蛋白质条带从凝胶切割成2-mm区段。将其擦干（用滤纸除去水）。＆nbsp;
  2. 干燥后，将这些片段溶解在0.1ml 0.1％SDS（pH6）中，在70℃下孵育1小时，然后在37℃下孵育过夜。＆nbsp;
  3. 通过在4,000℃下以12,000 x g >离心10分钟收集上清液。
    
    图3.蛋白质级分的SDS-PAGE分析。 A.吸光度峰值分别对应于B中的级分。 B.考马斯亮蓝染色后，在SDS-PAGE凝胶上显示分泌蛋白的级分。
视频1.凝胶过滤脱盐色谱法，用AKTA分离沉淀的蛋白质
质谱鉴定分泌蛋白
如前所述通过LC-MS / MS分析收集的上清液（Wang et al。>，2003; Ma et al。>，2015）。与通过质谱法鉴定的肽匹配的蛋白质用于进一步研究。
注意：为了进一步分析这些蛋白质，使用pP329载体或大肠杆菌（Rosetta）使用pET32a在巴斯德毕赤酵母（Km71）中表达。>

数据分析

基于分子量，通过凝胶过滤筛分色谱分离分泌的蛋白质。具有相似分子量的蛋白质将形成一个峰。峰的面积代表纯化蛋白质的丰度。随后将在每个峰中收集的蛋白质用于LC-MS / MS分析，并且数据显示在Ma 等人>（2015）中。

笔记

在细菌污染的情况下，可以在培养基中加入卡那霉素（50μg/μl）。
（NH 4 ） 2 SO 4 应缓慢加入培养基中，连续旋转。

食谱

V8果汁含2％琼脂（1升）
V8果汁：100毫升
CaCO 3 ：1克
ddH 2 O：900毫升
琼脂粉：20克
合成液介质（1L）
0.5g KH 2 PO 4
0.5克酵母提取物
0.25g MgSO 4 ·7H 2 O
0.001克硫胺素
25克葡萄糖
1克天冬酰胺
0.01克β-谷甾醇
加水至900毫升
用Milli-Q-fi ltered H 2 O混合并补足1L
TE缓冲区
含1 mM EDTA（TE）的10 mM Tris-HCl（pH 7.5）
10％SDS-PAGE凝胶
1. 分离凝胶缓冲液（10毫升）：
  4毫升Milli-Q-fi ltered H 2 O
  3.3毫升30％丙烯酰胺（Bio-Rad）
  2.5ml 1.5M Tris-HCl（Sigma-Aldrich）（pH8.8）
  0.1ml 10％SDS（Sigma-Aldrich）
  0.1ml 10％过硫酸铵（Sigma-Aldrich）
  0.004毫升TEMED（Bio-Rad）
2. 堆积凝胶缓冲液（3毫升）：
  2.1毫升Milli-Q过滤H 2 O
  0.5毫升30％丙烯酰胺（Bio-Rad）
  0.38ml 1.5M Tris-HCl（Sigma-Aldrich）（pH6.8）
  0.03ml 10％SDS（Sigma-Aldrich）
  0.03ml 10％过硫酸铵（Sigma-Aldrich）
  0.003毫升TEMED（Bio-Rad）
R-250染色溶液（100毫升）
甲醇：45毫升
ddH 2 O：45毫升
乙酸：10毫升
R-250考马斯：0.25克
Destaining解决方案（1升）
乙醇：乙酸：ddH 2 O = 1：1：2

致谢

作者要感谢马振川博士，这项工作的资金来自中国国家创新研究基金（资助编号31721004）的袁朝超，公共利益农业科研专项基金（201303018））和中国农业研究系统（CARS-004-PS14）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

Ma，Z.，Song，T.，Zhu，L.，Ye，W.，Wang，Y.，Shao，Y.，Dong，S.，Zhang，Z.，Dou，D.，Zheng，X。， Tyler，BM和Wang，Y。（2015）。 Phytophthora sojae >糖苷水解酶12蛋白是大豆中的主要毒力因子感染并被认为是PAMP。植物细胞> 27（7）：2057-2072。
Wang，Y.C.，Hu，D.W.，Zhang，Z.G.，Ma，Z.C.，Zheng，X.B.和Li，D.B。（2003）。新型 Phytophthora boehmeriae >蛋白的纯化和免疫细胞定位，诱导过敏反应，烟草和大白菜的系统获得性抗性。 Physiol Mol Plant Pathol > 63：223-232。