材料和试剂

1.5毫升Eppendorf管（Eppendorf，1毫升溶液）
5毫升Eppendorf管（Eppendorf，目录号：0030119401; 3毫升溶液可选，适用于厚脑切片或整装样品）
油漆刷（用于薄脑切片，1-2号，见图1）
硅橡胶板（半透明，0.2毫米厚; 例如>，AS ONE，目录号：6-9085-13;见图1）
注：各种厚度的硅橡胶板可从Togawa Rubber（AS ONE），Professional Plastics，CS Hyde等获得，范围从0.1 mm到8.0 mm。厚度应与脑切片的厚度相匹配。>
载玻片（76 mm x 26 mm; MATSUNAMI Glass;图1）
盖片（18 x 18 mm，No 1.5H; 例如>，Paul Marienfeld，目录号：0107032或ZEISS，目录号：474030-9000-000;图1）
注意：强烈建议不要使用1.5H（170±5μm厚）进行超分辨率成像。＆nbsp; >
氯化钠（NaCl）
磷酸氢钠十二水合物（Na 2 HPO 4 •12H 2 O）
氯化钾（KCl）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）
PBS中4％多聚甲醛（PFA; 例如>，NACALAI TESQUE，目录号：26126-25）
ddH 2 O中的20％皂苷（NACALAI TESQUE，目录号：30502-42），带过滤器灭菌
注意：不同的供应商从不同种类的植物中制备皂苷。我们强烈推荐NACALAI TESQUE。应避免使用褐色批次（通常在Sigma-Aldrich中找到）。>
低熔点琼脂糖（例如>，Thermo Fisher Scientific，目录号：16520100）
Omnipaque 350（例如>，DAIICHI SANKYO，Omnipaque 350注射液，50毫升1瓶;也可从GE医疗保健处获得）
Histodenz（例如>，Sigma-Aldrich，目录号：D2158）
叠氮化钠（例如>，Sigma-Aldrich，目录号：13412）
1M储备的Tris-HCl，pH 7.6（例如>，NACALAI TESQUE，目录号：35436-01），用于制备Tris-EDTA缓冲液
0.5M EDTA储备液，pH8.0（例如>，Dojindo，目录号：347-07481），用于制备Tris-EDTA缓冲液
沉浸式媒体：
用于SeeDB2G的甘油（例如>，G型浸没液，Leica Microsystems，目录号：11513910;甘油溶液，Leica Microsystems，目录号：11513872）
SeeDB2S的油（F型，Olympus，MOIL-30;也可从Leica，Zeiss，等获得>）
（可选）SeeDB2试剂盒（Wako Pure Chemical Industries，目录号：294-80701）＆nbsp;
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
Tris-EDTA缓冲液，pH 7.6（参见食谱）
渗透解决方案（见食谱）
解决方案1（见食谱）
解决方案2（见食谱）
SeeDB2解决方案（见食谱）
1. SeeDB2G含皂甙（清除）
2. SeeDB2G（安装）
3. SeeDB2S含皂甙（清除）
4. SeeDB2S（安装）
图1.准备成像室和切片安装所需的材料

设备

穿孔勺（可选用于处理厚脑片，定制，平头，头部直径= 15 mm，见图1和视频1）
环镊子（整装样品可选，例如>，Natsume Seisakusho，NAPOX，目录号：A-26，见图1）
4675/5000 Vibratome（例如>，LinearSlicer，DOSAKA，型号：PRO7N）
跷跷板振动器（例如>，Bio Craft，型号：BC-700）
旋转器（例如>，TAITEC，型号：RT-30mini，目录号：0057154-000）
荧光显微镜
1. 共聚焦显微镜（例如>，Olympus，型号：FV3000;徕卡显微系统，型号：Leica TCS SP8;尼康，型号：A1 +）
2. 超分辨率显微镜（例如>，Zeiss，型号：带有Airyscan的LSM 880; Leica Microsystems，型号：带有HyVolution 2的Leica TCS SP8; Leica Microsystems，型号：Leica TCS SP8 STED）
物镜镜头
实施例：63x油浸（NA = 1.4，WD = 0.14mm）（Leica Microsystems，型号：HC PL APO 63x / 1.4 Oil CS2，目录号：15506350）; 100x油浸（NA = 1.4，WD = 0.13mm）（Leica Microsystems，型号：HC PL APO 100x / 1.4 Oil CS2，目录号：15506325）; 63x甘油浸渍（NA = 1.3，WD = 0.28mm）（Leica，型号：HCX PL APO 63x / 1.30 GLYC CORR，目录号：11506193）; 63x油浸（NA = 1.4，WD = 0.19 mm）（Carl Zeiss，型号：Plan-Apochroamt 63x / 1.40 Oil DIC，目录号：440762-9904-000）

程序

光学清除协议的选择
1. SeeDB2G（RI = 1.46）：SeeDB2G针对甘油浸没镜片进行了优化，以实现最高分辨率，但水浸和多浸物镜也可以在合理的分辨率下使用。由于较低的粘度，SeeDB2G可用于较大的组织。
2. SeeDB2S（RI = 1.52）：SeeDB2S针对高NA油浸物镜进行了优化。由于SeeDB2S是粘性的并且油浸式镜片通常具有短W.D.（0.1-0.2mm），因此我们建议对SeeDB2S使用相对薄的样品（<300μm厚的切片）。
在该协议中，我们描述了用于小鼠脑切片的高分辨率/超分辨率成像的协议。然而，SeeDB2也可用于其他生物（例如>， Drosophila >），其他器官和样本类型（小鼠卵母细胞），培养细胞和冷冻切片的高分辨率成像。请参阅原始论文（Ke et al。>，2016）和 SeeDB资源了解详情。
注意：SeeDB资源（ https://sites.google.com/site/seedbresources/）提供作者的最新信息，见Ke et al。，2014。>
选择物镜和切片厚度
由于高NA镜头的工作距离限制，63x或100x镜头只能达到20x镜头可达到的深度的四分之一到一半。一定要选择靠近表面的神经元。参见表1，其中显示了用于共聚焦成像的物镜示例。

表1.物镜示例

+，最优; ±，非最优; -，不合适。基于Leica和Zeiss物镜的数据。
见DB2G（图2）
1. 在心脏内灌注4％PFA的PBS溶液后解剖小鼠脑。将脑样品在4％PFA中于4℃后固定，轻轻摇动过夜。
2. 在PBS中洗涤样品三次，轻轻摇动（每次10分钟）。
3. 将样品置于具有所需方向的4％低熔点琼脂糖/ PBS中，然后用振动切片机切割脑。
4. 将样品转移到透化溶液中并在4℃下振荡孵育过夜（> 16小时）。应在清除过程之前进行抗体染色和复染。
  可选：使用旋转器上的5ml Eppendorf管在3ml中进行抗体染色。用封闭缓冲液（0.5％脱脂乳，0.25％鱼明胶，PBS中2％皂苷）在4℃下封闭24小时后，将含有一抗的样品在洗涤缓冲液（PBS中的2％皂苷）中孵育24小时。用洗涤缓冲液洗涤三次后，用二抗和DAPI孵育样品12-16小时。在洗涤缓冲液中洗涤样品三次（每次2小时）。
  注意：我们建议2％皂苷用于浓缩小鼠脑样本;然而，对于较薄的切片，较低浓度的Triton X-100也是可行的。抗体能够深入渗透至200-300μm。>
5. 将样品转移到装有溶液1的新管中，并将其置于旋转器上。对于整装样品孵育6-10小时，对于切片样品（200-500μm）孵育2-4小时。
6. 将样品转移到装有溶液2的新管中，并将其放在旋转器上。对于整装样品孵育6-10小时，对于切片样品（200-500μm）孵育2-4小时。
7. 将样品转移到装有SeeDB2G和皂苷的新管中，并将其置于旋转器上。对于整装样品孵育6-10小时，对于切片样品（200-500μm）孵育2-4小时。传输图像的一个例子如图4所示。
  注意：>
  1. 不要将样品储存在含有皂苷的溶液中。对于薄切片或新生儿样品，在含有皂苷的溶液中延长温育（> 24小时）可能会对样品造成损害。>
  2. 将样品存放在SeeDB2G（不含皂甙）中，直至安装和成像。>
    SeeDB2清除的样品可以在4°C的Eppendorf中储存长达6个月。应加入叠氮化钠（0.05％）进行长期保存。>
见DB2S（图2）
1. 心内灌注PBS中的4％PFA后解剖小鼠脑。将脑样品在4％PFA中于4℃后固定，轻轻摇动过夜。
2. 在PBS中洗涤样品三次，轻轻摇动（每次10分钟）。
3. 将样品置于具有所需方向的4％低熔点琼脂糖/ PBS中，然后用振动切片机切割脑。
4. 将样品转移到透化溶液中并在4℃下振荡孵育过夜（> 16小时）。抗体染色和复染应在清除过程之前进行。
  注意：我们建议2％皂苷用于浓缩小鼠脑样本;然而，对于较薄的切片，较低浓度的Triton X-100也是可行的。抗体渗透深度可达200-300μm。>
5. 将样品转移到装有溶液1的新管中，并将其置于旋转器上。切片样品（200-500μm）孵育2-4小时。
6. 将样品转移到装有溶液2的新管中，并将其放在旋转器上。切片样品（200-500μm）孵育2-4小时。
7. 将样品转移到装有SeeDB2G和皂苷的新管中，并将其置于旋转器上。切片样品（200-500μm）孵育2-4小时。
8. 将样品转移到装有SeeDB2S和皂苷的新管中，并将其置于旋转器上。切片样品（200-500μm）孵育2-4小时。
9. 将样品转移到装有SeeDB2S的新管中（不含皂苷，可加入0.01％叠氮化钠进行长期储存）以进行安装。传输图像的一个例子如图4所示。
  注意：不要将样品储存在含有皂苷的溶液中。对于薄切片或新生儿样品，在含有皂苷的溶液中延长孵育（> 24小时）可能会对样品造成损害。>
图2. SeeDB2的图形协议
成像室准备和样品安装（视频1和图3）
1. （可选）将样品放在SeeDB2G / S中2-4小时以除去气泡。
  注意：如果气泡在管中积聚很多，将样品转移到装有SeeDB2G / S的新管中，孵育2-4小时。>
2. 使用剪刀或美工刀将硅橡胶板切成适当的尺寸。
3. 取下保护膜（粘在两侧，仅在0.2 mm硅胶片中找到）并将片材压在载玻片上。推动橡胶板以去除载玻片和橡胶板之间的气泡。
4. 将一滴SeeDB2G / S（从储存管中，而不是新鲜的管中）留入室内，然后用穿孔勺和油漆刷将脑片拿起以安装样品。
  注意：不要将脑切片放在干燥的表面上。不要将SeeDB2S溶液或SeeDB2S清除的样品暴露在空气中很长时间（> 5分钟）。>
5. （可选）用油漆刷清除成像室中的气泡。
6. 轻轻将盖玻片按压到成像室上，并使用SeeDB2G / S的溢出来密封盖玻片。有关安装样品的信息，请参见图3。
  注意：请勿使用指甲油密封样品。空气干燥后，过量的SeeDB2G / S会形成紧密的薄膜。>
7. 使用适当的浸入介质进行高分辨率荧光成像。 SeeDB2G使用甘油（折射率= 1.46），SeeDB2S使用油（折射率= 1.52; F型）。 SeeDB2G / S不能用作浸入式媒体。图5显示了共焦图像的示例。图6显示了超分辨率图像（Airyscan和STED）。
视频1.成像室准备和样品安装。用剪刀或美工刀将硅橡胶片（1毫米厚，0.2毫米厚，在此视频中显示）切成适当的大小。通过除去橡胶板和载玻片之间的空气，硅橡胶板将粘附到载玻片上。使用穿孔勺和油漆刷清除样品（清除的样品通常很难找到）。使用1.5H盖玻片密封样品。

图3.切片样品准备好成像。将220μm脑切片安装在成像室内。将硅橡胶片（0.2mm厚）用于间隔物，并放置盖玻片以密封样品。硅橡胶片将粘附在载玻片和盖玻片上而没有粘合剂。空气干燥后，SeeDB2G / S的溢出将形成紧密的薄膜。
预期结果（图4）

图4.使用SeeDB2G和SeeDB2S进行光学清除后500μm成年小鼠脑切片的透射图像（Ke et al。>，2016）。网格是2.6 x 3.2毫米。

数据分析

数据分析程序已在原始出版物中描述（Ke et al。>，2016）。本协议文件未进行统计分析。我们使用Neurolucida（MBF Bioscience）进行图5中的3D渲染。

图5.成人脑切片（ Thy1-YFP-H >小鼠）的共聚焦成像。成人脑切片（220μm厚）在共聚焦下用63x油浸镜头成像显微镜（Leica TCS SP8）。在PBS样品（未清除）中，由于光散射和球面像差，分辨率和荧光信号强度受到抑制。使用SeeDB2S清除时，所有深度都保持最高分辨率。

图6.成人脑切片（ Thy1-YFP-H >小鼠）的超分辨率成像。由于球面像差最小化，SeeDB2S也可用于各种超级 - 分辨率显微镜，例如STED（Leica），Airyscan（Zeiss），HyVolution2（Leica）和SpinSR（Olympus）。对于大规模超分辨率成像，我们首先使用20倍物镜成像。然后，我们专注于特定神经元并沿目标神经元获得超分辨率图像，以节省成像时间和数据量。我们使用Neurolucida（MBF Bioscience）来定量和重建神经元形态。图片改编自Ke et al。>（2016）。

笔记

皂苷溶液呈褐色
我们强烈推荐来自NACALAI TESQUE的皂甙。不同的供应商从不同种类的植物中制备皂苷。应避免使用褐色批次。或者，可以使用低浓度的Triton X-100。
Histodenz不完全溶解
在50ml锥形管中制备~10ml SeeDB2S溶液，以防止碘海醇粉末和Tris缓冲液混合不充分。使用旋转器轻轻搅拌。
SeeDB2解决方案中的白色或黄色聚合
为避免细菌污染，过滤并消毒20％皂苷原液。向每种澄清溶液中加入0.01％-0.1％的叠氮化钠，并将含有皂苷的溶液储存在4℃。
水蒸发
当水从表面蒸发时，SeeDB2的表面形成薄膜。在成像期间，应将DB2密封在成像室中。
在成像室/玻璃载玻片上密封样品
不应使用指甲油密封样品。对于厚样品，我们通常使用硅橡胶。为了将样品密封在载玻片上，我们使用过量的SeeDB2，然后在水蒸发后形成紧密的膜。
样本在SeeDB2中浮动
为了避免在成像过程中出现运动伪影，我们准备了比间隔物（半透明硅橡胶片）厚度略厚的脑片。例如，当我们使用200微米厚的橡胶板时，我们准备了220微米的脑切片。对于小样品，使用0.1％低熔点琼脂糖制备SeeDB2以固定样品也是有用的;我们使用低熔点琼脂糖成像小鼠卵母细胞样本。将小样品包埋在琼脂糖中也可用于避免在清除过程中样品的损失，因为通常难以从澄清溶液中找到不可见的样品。
运动神器
因为SeeDB2允许成像到物镜的工作距离（W.D.）的极限，所以当你接近上限时，玻璃载玻片经常被物镜向上推，这会导致运动伪影。我们建议使用夹具或在载玻片上放置砝码，以避免在成像过程中样品移动。
检测样品表面
由于SeeDB2的折射率与盖玻片的折射率相同，因此在进行荧光成像时很难确定样品的表面。确保将样品附在盖玻片上（见注6）。
光漂白
各种荧光蛋白（例如>，TagBFP2，ECFP，mTurquoise2，EGFP，EYFP，CyOFP，tdTomato，tdKatushka2）非常稳定并且对SeeDB2溶液中的光漂白具有抗性。实际上，SeeDB2比荧光蛋白的商业化安装介质表现更好。然而，一些Alexa染料和DAPI在SeeDB2中很容易被漂白。在这些情况下，我们建议2,2'-硫代二乙醇（TDE，折射率高达1.52）作为化学染料的替代品（Staudt et al。>，2007），然而，荧光蛋白在淬灭TDE。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
80克NaCl
29 g Na 2 HPO 4 •12H 2 O
2克KCl
2 g KH 2 PO 4
添加ddH 2 O以制备1L PBS
Tris-EDTA缓冲液，pH 7.6
10 mM Tris-HCl
0.25mM EDTA
透化解决方案
100μl20％皂苷溶液+900μlPBS
解决方案1
100μl20％皂苷溶液+333μlOmnipaque350+567μlddH2O
解决方案2
100μl20％皂苷溶液+500μlOmnipaque350+400μlddH2O
SeeDB2解决方案
注意：>
1. Tris-EDTA缓冲液pH 7.6（配方2）用于从Histodenz粉末制备SeeDB2S。不要使用PBS。磷酸盐缓冲液在长期储存后会产生白色沉淀物并影响成像质量。>
2. 0.01％叠氮化钠溶液可以包含在缓冲液中用于长期保存。不要长时间存储清算解决方案。>
3. 预制的SeeDB2解决方案也由FUJIFILM Wako Pure Chemical商业化。>＆nbsp;

致谢

该协议改编自我们最初的协议出版物（Ke et al。>，2016）。我们感谢J.R.Sanes提供Thy1-YFP-H鼠标系，R. Sakaguchi提供视频帮助，感谢M. Leiwe提供校对。这项工作得到了日本科学技术厅（JST）的PRESTO计划，日本医学研究和开发机构（AMED）的Brain / MINDS项目，三菱基金会，R＆amp; D战略计划的资助。 RIKEN（总统的全权委托基金），JSPS KAKENHI（授权号码23680038,15K14336,16K14568,16H06456,17H06261）和RIKEN CDB校内拨款。 M.-T.K.得到了RIKEN外国博士后研究员计划的支持。成像实验得到了RIKEN Kobe光学显微镜设备的支持。动物实验得到了RIKEN生命科学技术中心动物资源与基因工程实验室（LARGE）的支持。

利益争夺

M.-T.K.和T.I.已经分配给RIKEN的SeeDB2提交了专利申请。

参考

Ke，M。T.，Fujimoto，S。和Imai T.（2013）。 SeeDB：一种用于神经元电路重建的简单且形态保留的光学清除剂。 Nat Neurosci > 16（8）：1154-1161。
Ke，M。T.，Fujimoto，S。和Imai T.（2014）。使用SeeDB进行光学清算。生物协议> 4（3）：e1042。
Ke，M.T.，Nakai，Y.，Fujimoto，S.，Takayama，R.，Yoshida，S.，Kitajima，T。S.，Sato，M。和Imai，T。（2016）。神经元电路与指数优化清算代理的超分辨率映射。 Cell Rep > 14（11）：2718-2732。
Richardson，D。S.和Lichtman，J。W.（2015）。澄清组织清除。 Cell > 162（2）： 246-257。
Richardson，D。S.和Lichtman，J。W.（2017）。 SnapShot：组织清除。 Cell > 171（2）：496-496.e1。
Staudt，T.，Lang，M。C.，Medda，R.，Engelhardt，J.，Hell，S。W。（2007）。 2,2'-硫代二乙醇：一种用于高分辨率光学显微镜的新型水溶性封固剂。 Microsc Res Tech。> 70（1）：1-9。