材料和试剂

移液器吸头
250毫升Stericup过滤装置（默克，目录号：SCGPU02RE）
Coverslips（Fisher Scientific，目录号：12-543D）
Kimwipes（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34155）
超细注射器（BD，目录号：324911）
从新收集的尸检标本中选择人冠状动脉样本（来自CVPath登记处）
[可选]一岁的apoE基因敲除（KO）小鼠（THE JACKSON LABORATORY，目录号：002052）
EcoMount（Biocare Medical，目录号：EM897L）
CoverMount用于非EBD染色，基于二甲苯（Avantik，目录号：SL6012-A）
伊文思蓝染料（Sigma-Aldrich，目录号：E2129-50G）
FITC-dextran（Sigma-Aldrich，目录号：46945）
5％BSA（Fisher，目录号：BP1600-100）
PBS（1x，Ultra Pure Grade，VWR，目录号：97063-658）
中性缓冲福尔马林（NBF）（Sigma-Aldrich，目录号：HT501128）
Tissue-Tek ® O.C.T.化合物（Sakura Finetek，Miles，目录号：4583）
过氧化氢H 2 O 2 3％（VWR，目录号：BDH7540-2）
Dako蛋白质块（Agilent Technologies，DAKO，目录号：X0909）
CD163抗体（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-20066，克隆GHI / 61）
CD68抗体（Dako，clone Kp1）
血管性血友病因子（vWF）抗体（SDIX，Strategic BioSolutions，目录号：S4003GND1）
缺氧诱导因子1α（HIF1α）抗体（Novus Biologicals，目录号：NB100-105）
血管内皮生长因子-A（VEGF-A）抗体（BioGenex，目录号：PU483-UP）
VE-钙粘蛋白抗体（R＆amp; D Systems，目录号：AF1002，稀释度1：100，和BD Biosciences，目录号：555661）
血管细胞粘附蛋白（VCAM）抗体（Abcam，目录号：ab134047）
CD3抗体（Roche Diagnostics，目录号：790-4341，预稀释）
生物素化的山羊抗兔，马抗小鼠和兔抗山羊（Vector Laboratories，目录号：BA-1000，BA-2000，BA-5000，分别）
Alexa Flour 488和555链霉抗生物素蛋白（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：S32354和S32355，分别）
DAPI（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：D3571）
2-甲基丁烷（Spectrum Chemical Manufacturing，目录号：M1246）
液氮
20％多聚甲醛（Electron Microscopy Sciences，目录号：15713-S）
丙酮（Fisher Scientific，目录号：A929-1）
液体阻滞剂（Ted Pella，目录号：22309）
冰醋酸（Fisher Scientific，目录号：A38-212）
苏木精和伊红
1. 二甲苯，试剂等级/ ACS（Avantik，目录号：RS4050）
2. 安装介质/ Permount（Fisher Scientific，目录号：SP15-500）＆nbsp;
3. 来自实验室的去离子水
4. Mayer的苏木精解决方案（Astral Diagnostics，目录号：7020）
5. Gill 3（Sigma，目录号：GHS3128）
6. 伊红 - phloxine染色（Astral Diagnostics，目录号：7010）
7. 100％试剂酒精（Avantik，目录号：RS4029）
8. 95％试剂级酒精（Avantik，目录号：RS4031）
9. 氢氧化铵，ACS级（Sigma-Aldrich，目录号：A6899）
伊文思蓝染料溶液（见食谱）

设备

移液器
肚脐振动筛（IBI Scientific）
Axio Scan.Z1数字幻灯片扫描仪（Carl Zeiss，目录号：Axio Scan.Z1）
使用切片刀片的明亮OTF 5000切片机低温恒温器（Hacker Instruments，Hacker，目录号：OTF 5000）（Thermo Fisher Scientific，目录号：3152735）
CryoJane磁带传输系统（Leica Biosystems，目录号：39475205）
LSM 800共焦激光扫描显微镜（Carl Zeiss，目录号：LSM 800）
奥林巴斯BX51显微镜（奥林巴斯，型号：BX51）
RNAscope Probe-Hs-CD163-C2（高级细胞诊断，目录号：417061-C2）
RNAscope Probe-Hs-VEGFA（高级细胞诊断，目录号：423161）
TLE系列超低温冰箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific TM ，目录号：TLE60086A）
Stemi DV4立体解剖显微镜（蔡司，型号：Stemi DV4）

软件

HALO图像分析平台（Indica Labs）2.0版
Zen Blue 2012（卡尔蔡司）2.0版
Zen Black 2012（卡尔蔡司）2.0版

程序

准备和冷冻组织
1. 选择新鲜收集的尸检人类心脏伴冠状动脉疾病。样品必须具有小于12小时的死后间隔（PMI）截止值以及基于心脏的X射线图像（其将允许检测血管钙化）的晚期动脉粥样硬化的证据。（图1）
  
  图1.心脏的数字X射线图像。突出的亮点是冠状动脉的钙化（红色箭头）。在冠状动脉之间的中心可以看到主动脉瓣的钙化。
2. 准备含有5％BSA的盐水溶液。
3. 通过将伊文思蓝粉末溶解在含BSA的盐水中制备0.5％伊文思蓝染料溶液。
4. 使用250 ml Stericup过滤装置过滤Evans Blue Dye溶液。＆nbsp;
5. 将过滤后的Evans Blue灌注到右侧和左侧冠状动脉中，在37°C下通过重力流量平均压力约为60 mmHg进行15分钟。＆nbsp;
6. 使用相同的重力灌注方法，用500ml PBS洗涤埃文斯蓝灌注样品20分钟。
7. 接下来，用500ml中性缓冲福尔马林固定样品20分钟。
8. 收获福尔马林固定的冠状动脉组织样品，并置于含有50ml 15％蔗糖的PBS溶液中，在4℃下在Falcon管中过夜。
9. 从蔗糖溶液中取出组织并用Kimwipes干燥。
10. 以2-3毫米的片段间隔切割收获的样品。
11. 在解剖范围内，检查每个冠状动脉段是否有可见的斑块内Evan Blue染色区域（图2A）。＆nbsp;
12. 通过在O.C.T.中浸渍组织来冻结样品。嵌入媒体。然后将组织置于标记的冷冻模具中，并用更多的O.C.T.
13. 在化学通风橱中，使用适当的PPE，将一瓶甲基丁烷浸入装有液氮的容器中，冷却一瓶甲基丁烷。确保液氮到达甲基丁烷的弯液面。让它冷却1-2分钟。
14. 在化学罩中，将O.C.T.填充的冷冻模型安装在箔衬里的容器中，并使用镊子或冷冻球，从液氮中除去甲基丁烷，并将足够的甲基丁烷倒入箔衬里的容器中以包围模具。确保没有甲基丁烷超过冷冻模的顶部。用隔热盖盖住容器，让样品冷冻2-5分钟，或直到O.C.T完全冷冻。
15. 从甲基丁烷中取出冷冻模型，并储存在单独标记的小塑料袋中。将冷冻块储存在-80°C的条件下。
16. 使用切片机低温恒温器，从每个冷冻块切下10微米厚的切片并放在载玻片上。切割足够3种评估方法：染色，组织学和免疫荧光分析。风干载玻片用于Evans Blue成像，使用Eco-mount进行盖玻片（图2B）。将未染色的载玻片存放在-80°C的黑暗中，直到准备好使用共聚焦显微镜进行免疫荧光分析。
  
  图2.Evans Blue Dye灌注人冠状动脉。 A.灌注后冠状动脉的总体图像。黄色区域是富含脂质的斑块。深蓝色至黑色是伊文思蓝染色区域，参见B中蓝色染色的相应冷冻切片（浅蓝色区域是A中管腔表面光线的反射）。 B.来自同一动脉的冷冻切片。
[可选程序] 在小鼠研究中使用Evan Blue染料或FITC-葡聚糖
1. 一年前开发的先进动脉粥样硬化斑块的apoE敲除（KO）小鼠可用于通过施用的Evan Blue染料或FITC-葡聚糖溶液进行的斑块内渗透性研究。
2. 通过将FITC-葡聚糖溶解在PBS（10mg / ml）中制备FITC-葡聚糖溶液。＆nbsp;
3. 通过静脉内注射FITC-葡聚糖。使用超细注射器在异氟烷麻醉条件下施用50μg/ g体重。
4. 注射FITC-葡聚糖后1小时处死小鼠。
5. 可选：可以使用荧光板读数器收集血样用于测量血清FITC-葡聚糖水平。
6. 使用注射泵或通过重力用20ml PBS溶液灌注小鼠穿过左心室，用20ml 4％多聚甲醛灌注固定，然后用20ml PBS漂洗。灌注程序如前所述（Gage et al。>，2012）。
7. 在解剖范围内用头臂动脉仔细解剖心脏和主动脉。
8. 在O.C.T.中嵌入主动脉根部和头臂动脉。和如上所述的部分。
9. 该部分中的FITC-葡聚糖可以通过如下所述的共聚焦显微镜成像（图3）。
  
  图3.代表性免疫荧光共聚焦显微镜图像的斑块内FITC-葡聚糖（绿色）作为渗透性的标记。比例尺：100μm。从用FITC-葡聚糖灌注的BCA斑块的共聚焦图像定量总斑块内FITC荧光以确定渗透性。（改编自Guo et al。>，2018年的图5J）
双重免疫荧光染色
1. 温热冷冻至室温10-20分钟。
2. 通过将载玻片置于冷（约-20℃）丙酮中10分钟来固定冷冻切片。允许切片在室温下风干10分钟，然后用液体阻断剂勾勒出部分，并在室温下风干10-20分钟。
3. 将载玻片暴露于0.15％H 2 O 2 20分钟。＆nbsp;
4. 接下来，在与一抗孵育之前，在设置为中速的Belly Button振荡器上用Dako蛋白块处理所有切片10分钟。＆nbsp;
5. 准备1％BSA的PBS溶液。准备足够的这种溶液稀释所有的一抗。
6. 对冷冻切片进行CD163 / VE-钙粘蛋白和VE-钙粘蛋白/ VCAM（两对阴性对照）的免疫荧光一抗双重染色（应用足够量的抗体或阻断溶液以覆盖组织切片）：
  1. 在含有1％BSA溶液的PBS中如下稀释一抗：
    1. 制备1：200稀释的CD163克隆GHI / 61。
    2. 制备VE-钙粘蛋白的1：100或1：400稀释液。
    3. 对VCAM进行1：100稀释。
  2. 从载玻片上除去蛋白质块并进行双重染色，将CD163与VE-钙粘蛋白配对，以及将VE-钙粘蛋白与VCAM配对。
  3. 将第一个一抗添加到测试和阳性对照载玻片中并在振荡器上孵育，如下所述。在一抗孵育之间，去除第一个一抗，在摇床上用PBS冲洗载玻片3次，持续5分钟，取出PBS，然后加入第二个一抗，并如下所述在振荡器上孵育。通过在PBS中代替一抗孵育同时处理阴性对照，在室温下孵育1小时或在4℃下孵育过夜。在以下条件下用一抗孵育测试载玻片：
    1. 孵育在1：200稀释的CD163克隆GHI / 61中，在4℃下过夜。＆nbsp;
    2. 在4℃下以1：100或1：400稀释的VE-钙粘蛋白孵育过夜。
    3. 在室温下1：100稀释的VCAM中孵育1小时。
  4. 去除第二个一抗，在摇床上用PBS冲洗载玻片3次，每次5分钟，然后取出PBS。
7. 通过将测试载玻片和阳性对照载玻片与生物素化的抗小鼠二抗一起温育来进行一抗检测，所述生物素化的抗小鼠二抗在室温下在摇床上以1：200在PBS中稀释30分钟。保持稀释直至准备使用，并在孵育期间保持载玻片覆盖以保护二抗不受光照。＆nbsp;
8. 去除二抗，在摇床（覆盖）上用PBS冲洗载玻片3次，每次5分钟，并除去PBS。
9. 将所有载玻片（包括阳性和阴性对照）孵育在Alexa Flour 488和555链霉抗生物素蛋白中，在PBS中1：100稀释，在摇床上在室温下孵育30分钟。保持覆盖。
10. 去除链霉抗生物素蛋白并用PBS漂洗载玻片3次，每次5分钟，在室温下在振荡器上盖上盖子。
11. 使用DAPI计算所有幻灯片。在PBS中稀释DAPI（稀释度应通过滴度测定确定，并且可以按批次变化，约1：1,000稀释是一个良好的开始）。将稀释的DAPI加入到测试和对照载玻片中，并在室温下在振荡器上孵育通过滴定测定的时间。在孵化期间保持覆盖。
12. 去除DAPI并用PBS冲洗载玻片3次，每次5分钟，在室温下在振荡器上盖上盖子。
13. 将所有载玻片置于10％中性缓冲福尔马林中10分钟（盖上）。用移液管移除。
14. 用PBS冲洗载玻片3次，每次5分钟，在室温下在振荡器上盖上盖子。
15. 移除PBS并使用荧光兼容的封固剂涂覆盖玻片。将载玻片在2-8℃下在黑暗中储存，直到准备好使用共聚焦显微镜进行免疫荧光分析。
苏木精和伊红染色
1. 温热滑至室温，10-20分钟。
2. 在Mayer's苏木精溶液中染色载玻片（使用前过滤）10-20分钟。如果Mayer的苏木素溶液不可用，则在Gill 3溶液中染色1-6分钟。
3. 在温热的自来水中洗涤载玻片以除去苏木精，直到载玻片清澈并且细胞核呈蓝色。
4. 如果组织致密并且染色不正确，将载玻片放入1％冰醋酸中3-10秒，然后用温水冲洗。
5. 如果载玻片不是蓝色，则将它们置于氨水（5-10滴浓氢氧化铵在大型染色皿中加水）中3秒或更长时间。
6. 用自来水清洗载玻片，换水4-5次。
7. 将载玻片置于80％试剂酒精中1分钟或5-10滴。
8. 在Eosin-Phloxine Stain（Eosin Y / Phloxine B Working Solution）中染色载玻片（使用前过滤）1-3分钟。
9. 将载玻片置于梯度醇中，然后用二甲苯：95％乙醇，1-2滴，使载玻片脱水; 100％酒精，1-2蘸; 100％酒精，20秒-1分钟（重复3次，每次使用新鲜酒精）;二甲苯1-3分钟（重复3次，每次使用新鲜二甲苯）。
10. 如果需要，检查载玻片上是否有正确的染色并重新接触苏木精。核染色质应呈现蓝色，细胞质应呈粉红色至红色。
11. 使用Permount将盖玻片安装到载玻片上。
埃文斯蓝明场成像
使用Axio Scan.Z1载玻片扫描仪和Carl-Zeiss显微镜Zen软件蓝版2.0版获取Evans Blue载玻片的明视野图像。
1. 将幻灯片加载到Axio Scanner中。
2. 检查固定要扫描的幻灯片的相应托盘后，选择“预扫描”和相应的“预扫描设置”。
3. 通过打开“组织检测向导”查看预扫描的图像和要扫描的区域。如有必要，使用“多边形轮廓工具”更改自动检测。审核完成后，选择“已完成”。
4. 粗焦点贴图使用“点数”设置，精细焦点贴图使用“洋葱皮”设置。
5. 命名幻灯片，选择要保存的位置，然后选择“扫描”。
荧光成像
1. 使用Zeiss LSM 800或880共聚焦显微镜和Carl-Zeiss Microscopy Zen软件（分别为蓝色版本2.0和黑色版本2.0）捕获测试和控制载玻片的Z-堆叠图像，使用不同的通道进行共检测基于所进行的双重染色，根据需要使用CD163，VE-钙粘蛋白和VCAM。
2. Evans Blue染料和FITC-葡聚糖也可以使用共聚焦显微镜成像。在采集中使用lambda模式和光谱分离来减少其他噪声信号。代表性的图像可以在原始文章中的图5J中找到（Guo 等人，>，2018）。

数据分析

使用EBD灌注的人冠状动脉的横截面图像量化Evans Blue阴性和阳性区域。图4A中的图像显示重度EBD染色区域具有被CD163 + 巨噬细胞包围的斑块内微血管。在EBD阳性与EBD阴性区域中微血管，CD163 + 巨噬细胞和VCAM的定量显示显着更高的微血管密度，更多CD163 + 巨噬细胞和EBD中上调的VCAM表达斑块中的阳性与EBD阴性区域。使用双侧Student's t > -test实现两组之间的比较。这些分析的更多细节可以在最初的研究文章中找到（Guo et al。>，2018）。

图4.通过EBD灌注评估人冠状动脉微血管通透性。 A.EBD灌注的人冠状动脉，H＆amp; E染色图像和CD163（红色）和CD163的共聚焦免疫荧光图像的代表性图像EBD阴性区域（顶行），EBD阳性区域1（中间行）和EBD阳性区域2（底行）中的VE-钙粘蛋白（黄色）或VE-钙粘蛋白（红色）和VCAM（绿色）。正区域1和2在第二和第三行中从左到右逐渐增大的H＆amp; E染色图像中示出。红色和白色箭头指向微血管。 CD163 / VE-钙粘蛋白和VE-钙粘蛋白/ VCAM的EBD阴性区域的共聚焦图像分别显示在第3列和第4列的顶行，而阳性区域1显示为中间的CD163 / VE-钙粘蛋白。在第3列和第4列的行的底部（右侧的放大倍率图像）中示出了用于VE-钙粘蛋白/ VCAM的第3列和第4列（右侧的放大倍数较高的图像）和正区域2的行。 B-d。在EBD阳性区域与EBD阴性区域中微量血管密度，CD163 + 巨噬细胞和VCAM的定量。（改编自Guo et al。>，2018年的图7）

笔记

人冠状动脉疾病中斑块内血管生成和渗透性的程度存在一定的变异性。一岁的apoE敲除小鼠可以是研究斑块内出血和通透性的动物模型。然而，由于小鼠动脉的大小相同，小鼠动脉粥样硬化病变中的斑块内血管生成比人类病变更难以确定。

食谱

0.5％伊文思蓝染料溶液（100毫升）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>埃文斯蓝染料
0.5克
牛血清白蛋白
5.0克
0.9％NaCl盐水
100毫升储存在4°C

致谢

该协议改编自Guo 等人>（2018）。该研究由CVPath研究所资助，CVPath研究所是一家致力于研究心血管疾病及其治疗的非营利性研究所。

利益争夺

作者没有任何潜在的利益冲突申报。

伦理

涉及使用经鉴定的人类病理学或尸检标本的研究被CVPath研究所的IRB批准免除审查。 MedStar健康研究所的IACUC批准了所有动物协议。所有动物实验均根据NIH的实验动物护理和使用指南（National Academies Press，2011）进行。

参考

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