材料和试剂

小鼠抗人CD107a PE（克隆H4A3）（BD Biosciences，目录号：555801）
小鼠抗人CD3 PE-Cy7（克隆UCHT1）（Biolegend，目录号：300420）
小鼠抗人CD8 Alexa-Fluor-700（克隆3B5）（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：MCHD0824）
注意：上述抗体已经被作者测试，可能被用户需要的抗体替代。
CFSE（Molecular Probes Europe BV）
Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）（Life Technologies，Invitrogen TM）
热灭活的胎牛血清（FCS）（Integro）
人血清（HS）（Sanquin Blood Bank）
重组人IL-2（Proleukin，Chiron）
重组人IL-15（Immunotools，目录号：11340155）
抗原特异性肽（例如 MiHA或CMV肽，Thinkpeptides）
APC偶联的抗原特异性四聚体（由荷兰莱顿大学医学中心Dr.Fr.F.Falkenburg教授提供）
Sytox blue（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：S34857）
成熟单核细胞衍生的DC [按照Hobo等人（2010）所述的方案培养]
FACS缓冲区（参见配方）

设备

Beckman Coulter Navios流式细胞仪
24孔板
37℃孵育器

程序

抗原特异性T细胞增殖和脱颗粒
1. 用14ml PBS洗涤含有低百分比的抗原特异性T细胞的PBMC
2. 在室温（RT）下以500×g离心细胞5分钟
3. 将细胞在PBS中重悬浮至浓度为20×10 6个细胞/ml，并以1:1的比例加入2.5μMCFSE（因此在500μl细胞悬浮液的情况下，加入500μl2.5μM CFSE）。 CFSE的最终浓度为1.25μM
4. 在室温下孵育细胞10分钟。
5. 然后，以1:1的比例加入纯FCS（因此在1ml CFSE细胞悬浮液的情况下，加入1ml FCS）。
6. 2分钟后，用14ml IMDM/10％HS洗涤PBMC两次（在室温下以500×g离心细胞5分钟），并计数细胞数。
7. 在IMDM/10％HS中将PBMC重悬浮至浓度为2×10 6个细胞/ml。
8. 在24孔板的每孔中加入500μlPBMC悬浮液
9. 使用表达正确HLA分子的成熟单核细胞衍生的DC进行刺激
10. 用14ml PBS洗涤DC。
11. 在室温下以500×g离心细胞5分钟。
12. 然后将DC重悬在500μl含有10μM抗原特异性肽的IMDM中
13. 在孵育箱中37℃孵育DC 30分钟
14. 向DC中加入14 ml PBS
15. 在室温下以500×g离心细胞5分钟。
16. 将DC在IMDM/10％HS中重悬浮至浓度为0.2×10 6个细胞/ml。
17. 向每个含有CFSE标记的PBMC的孔中加入500μlDC悬浮液
18. 在37℃，5％CO 2和95％湿度的培养箱中培养细胞。
19. 5天后，从每个孔中取出500μl上清液，并加入500μl含有100U/ml IL-2和10ng/ml IL-15的IMDM/10％HS，因此孔中的终浓度为50U/ml IL-2和5ng/ml IL-15。上清液可用于细胞因子分析
过夜再刺激
1. 在培养的第7天，除去500μl上清液
2. 向每个孔中加入500μl含有10μM抗原特异性肽的IMDM/10％HS，因此最终浓度为5μM抗原特异性肽。
3. 另外，向每个孔中加入6.5μlCD107a-PE抗体
4. 在37℃，5％CO 2和95％湿度的培养箱中培养细胞过夜。
5. 第二天，收获培养的细胞并计数细胞数
6. 在室温下以500×g离心细胞5分钟。
7. 重悬细胞在100微升IMDM/10％HS和添加1微升APC结合的抗原特异性四聚体。
8. 在黑暗中，室温下孵育细胞20分钟。
9. 然后（无需预先洗涤！），加入2.5μlCD3 PE-Cy7和1μlCD8 Alexa-Fluor-700。
10. 孵育细胞在冰上，在黑暗中30分钟。
11. 随后，用1ml FACS缓冲液洗涤细胞
12. 在室温下以500×g离心细胞5分钟。
13. 将细胞重悬在300μl含有0.1％Sytox蓝色溶液的FACS缓冲液中
14. 在Navios流式细胞仪上分析样品
15. 流式细胞分析：
  1. 门对白细胞（向前/侧向散射）
  2. 门在活细胞（Sytox蓝色阴性）
  3. 门对细胞毒性T细胞（CD3阳性，CD8阳性）
  4. 在四聚体阳性CD8 ⁺ T细胞上的门
  5. 分析四聚体阳性CD8 ⁺ T细胞的CFSE稀释模式（NB。使用四聚体阴性细胞设置未分裂细胞的门）
  6. 分析四聚体阳性CD8 + sup + T细胞内的CD107a阳性（NB。使用四聚体阴性细胞设置CD107a细胞的门）

食谱

FACS缓冲液（0.5L）
2.5g BSA在500ml PBS中的溶液

致谢

该协议已经由Hobo等人的出版物（2012）修改。我们感谢Rob Woestenenk在流式细胞术中的帮助和Michel Kester为我们提供四聚体。这项工作是由赠款支持来自荷兰癌症协会（KWF 2008-4018）和Radboud大学Nijmegen（UMCN 2007-34）。

参考文献

Hobo，W.，Maas，F.，Adisty，N.，de Witte，T.，Schaap，N.，van der Voort，R。和Dolstra，H。树突状细胞上的PD-L1和PD-L2的siRNA沉默增强了小的组织相容性抗原的扩增和功能特异性CD8 + T细胞。血液 116（22）：4501-4511。
Hobo，W.，Norde，WJ，Schaap，N.，Fredrix，H.，Maas，F.，Schellens，K.，Falkenburg，JH，Korman，AJ，Olive，D.，van der Voort，，H。（2012）。 B和T淋巴细胞衰减子介导同种异体干细胞移植后患者肿瘤反应性CD8 + T细胞的抑制。 J Immunol 189（1）：39-49