材料和试剂

94 mm板（Greiner Bio One International，目录号：633185）
15毫升锥形管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
1.5毫升管（Greiner Bio One International，目录号：616201）
颗粒杵（Sigma-Aldrich，目录号：Z359947-100EA）
玻璃载玻片（Fisher Scientific，目录号：12164682）
硝化纤维素（Bio-Rad Laboratories，目录号：1620112）
℃。线虫>菌株
大肠杆菌> OP50菌株
去离子水（dH 2 O）
胆固醇（Fisher Scientific，目录号：10263660）
乙醇绝对值（默克，目录号：1009831000）
硫酸镁（MgSO 4 ）（Fisher Scientific，目录号：10264630）
二氯化钙（CaCl 2 ）（Fisher Scientific，目录号：10171800）
二磷酸氢钾（K 2 HPO 4 ）（默克，目录号：105101）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（默克，目录号：104873）
酪蛋白消化，Difco（BD，目录号：211610）
选择琼脂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen TM ，目录号：30391049）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Acros Organics，目录号：424380010）＆nbsp;
氯化钠（NaCl）（默克，目录号：106404）
DL-二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
HEPES（西格玛奥德里奇，目录号：H4034）
氢氧化钾（KOH）（Fisher，目录号：10705921）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：10010310）
二氯化镁（MgCl 2 ）（Fisher Scientific，目录号：10518060）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
蔗糖（Fisher Scientific，目录号：10386100）
吐温20（西格玛奥德里奇，目录号：P1379-100ML）
蛋白酶抑制剂（cOmplete）（罗氏，目录号：11697498001）
Benzonase核酸酶（默克，目录号：70746）
Pierce TM BCA蛋白质分析试剂盒（赛默飞世尔科技，目录号：23225）
液氮
过硫酸铵（APS）（赛默飞世尔科技，目录号：A / 6120/60）
N >， N >， N >'， N >' - 四甲基乙二胺（TEMED）（Fisher Scientific，目录号：10142863 ）
40％丙烯酰胺/双溶液（29：1）（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610146）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Merck，Calbiochem，目录号：428015）
Tris Base（罗氏诊断，产品目录号：11814273001）
盐酸37％（Acros Organics，目录号：124630010）
甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：10070150）
甲醇（默克，目录号：106009）
Bromophenol blue（Acros Organics，目录号：403160100）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
β-Mercaptoethanol（Merck，目录号：444203）
奶粉（Campina）
PageRuler TM Plus Prestained Protein Ladder（赛默飞世尔科技，目录号：26619）
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent（GE Healthcare，目录号：RPN2236）
抗体（见表1）

表1.一抗和二抗列表
bordercolor =“＃000000”style =“width：800px;” border =“1”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>一抗
主持人
公司/目录 style =“background-color：transparent; box-sizing：border-box; color：＃333333; font-family：＆amp; font-size：14px; font-style：正常;字体变量：正常;字体重量：700;字母间距：正常;孤儿：2;文本对齐：左;文字修饰：无;文本缩进：0像素;文字变换：无; -webkit -text-stroke-width：0px; white-space：normal;字间距：0px;“> number
稀释一抗
二抗
α-LMN-1
兔子
Novus Biologicals，
目录号：
38530002
1：1,000
Anti-rabbit（1：10,000）
（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706515）
α-微管蛋白
老鼠
Sigma-Aldrich，
目录号：
T6074
1：10,000
Anti-Mouse（1：10,000）
（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706516）
α-GFP＆nbsp;
（生活颜色^{® Av单克隆抗体（JL- 8）
老鼠

Takara Bio，
目录号：
632381
1：10,000
Anti-Mouse（1：10,000）
（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706516）}
M9缓冲区（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
PBS-T（见食谱）＆nbsp;
阻止解决方案（见食谱）
线虫生长培养基（NGM）板（见食谱）
磷酸盐缓冲液（见食谱）
低渗缓冲液（见食谱）
高渗缓冲液（见食谱）
25x蛋白酶抑制剂（见食谱）
1 M DTT（见食谱）
12％丙烯酰胺凝胶（见食谱）
运行缓冲区（参见食谱）
转移缓冲区（见食谱）
SDS裂解缓冲液（见食谱）

设备

单通道移液器（Gilson，型号：P2G，P20G，P200G，P1000G）
轨道振动筛（Thermo Fisher Scientific，型号：MaxQ TM 2000）
20°C培养箱（Winecooler，LIEBHERR，型号：WK 4126）
立体显微镜（徕卡，型号：MZ7.5）
颗粒研杵（马达）（Sigma-Aldrich，目录号：Z359971）
台式离心机，冷却（Eppendorf，型号：5424 R）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：SL 40R）
高压灭菌器（VWR，型号：VAPOR-Line Lite）
-80°C冰柜（三洋，型号：VIP plus）
Mini PROTEAN 3系统（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658001edu）
WB Imager（GE Healthcare，型号：ImageQuant LAS 4000 mini，目录号：28955813）

软件

ImageJ（开源： https://imagej.nih.gov/ij/ ）
Microsoft Excel（Microsoft Corporation，Redmond，USA）

程序

收集蠕虫
1. 准备10-15块漂白同步蠕虫板，每9厘米NGM板约800-1,000个蠕虫，以获得相对较大的核部分。
  注意：我们进行了亚细胞分离实验，每种情况下只需5 x 9 cm NGM板。然而，使用10 x 9 cm NGM板将产生更可行的核部分，因为在洗涤步骤中颗粒将更容易被看到。>
2. 将蠕虫在20°C孵育约72小时，直至成年第1天（D1）。
  注意：亚细胞分离可以在不同年龄的蠕虫中进行。在这里，我们描述了成年后第一天的蠕虫协议（D1）。然而，该方案对于L4阶段的动物和较老的蠕虫也是可行的。人们应该记住，使用颗粒杵比较老的蠕虫更容易打破幼虫的角质层。因此，应根据蠕虫的年龄（7-12次）调整中风次数。>
3. 在15ml锥形管中收集每板约4ml M9的D1阶段蠕虫并洗涤直至上清液澄清（3-5次）。
4. 用1 ml冷低渗缓冲液清洗蠕虫沉淀两次。
5. 每个样品准备2-5 ml'完全低渗缓冲液'，加入1 M DTT（终浓度：1 mM DTT）和25x蛋白酶抑制剂（终浓度：2x蛋白酶抑制剂）至几毫升标准低渗缓冲液。
  注意：建议计算实验所需的“完整低渗缓冲液”的体积。移取所需体积的低渗缓冲液，加入DTT和蛋白酶抑制剂;化合物应储存在-20°C。>
6. 去除所有低渗缓冲液并加入'完全低渗缓冲液'，如步骤A5中制备的（~500μl）。将蠕虫悬浮液转移到1.5毫升管中。
  注意：估计蠕虫颗粒的体积并添加相同体积的“完整低渗缓冲液”。>
7. 此时避免冻结蠕虫沉淀，因为这可能会破坏细胞核并导致细胞质中核蛋白质的泄漏。
分馏
1. 用颗粒杵将蠕虫均化1分钟，让蠕虫静置1分钟，重复5到10次。在整个过程中将蠕虫保持在冰上。用研杵研磨沉淀4-5次后，将5μl蠕虫悬浮液移液到载玻片上，以评估蠕虫裂解的程度。当70％-80％的蠕虫被破坏并且只有少量蠕虫残留物可见时，均质化就完成了（见图1）。
  
  图1.蠕虫均质化的示例 A.不完全均质化。 B.完全同质化。
2. 通过在500 x g >，4°C下旋转5分钟来使蠕虫体和碎屑沉淀。
3. 将上清液转移到新的1.5 ml管中，再以500 x g >，4°C旋转5分钟，以确保清除所有蠕虫碎片。
4. 将上清液转移到新的1.5ml管中。在新的1.5 ml管中保存25-30μl该部分（'输入分数'）并保持在冰上。记下上清液的总体积。丢弃颗粒。
5. 将核以4,000 x g >，4°C沉淀5分钟。
6. 将上清液转移到新的1.5ml管中，以最大速度（17,000 x g >），4℃离心30分钟。将上清液转移到新的1.5ml管中;这将包含'细胞质成分'。
7. 用500μl'完全低渗缓冲液'（如步骤A5中制备）洗涤来自步骤B5的沉淀，并将样品在4,000 x g >，4℃下离心5分钟。
8. 弃去上清液并加入500μl新鲜的“完全低渗缓冲液”（如步骤A5中制备）以重悬核颗粒并将悬浮液移液到新的1.5ml管中。将样品在4,000 x g >，4°C离心5分钟。
  注意：每次清洗后换管都很重要，因为微管蛋白和脂肪物质往往会粘在管壁上，这可能会污染核部分。>
9. 通过向高渗缓冲液中加入1M DTT（终浓度：1mM DTT）和25x蛋白酶抑制剂（终浓度：2x蛋白酶抑制剂）来制备'完全高渗缓冲液'。
10. 除去上清液并将沉淀溶解在少量“完全高渗缓冲液”中（如步骤B9中制备）（步骤B4中记录的体积的一半或更少）。记下用于溶解核部分的体积。将悬浮液转移到新的1.5毫升管中;这将包含'核分数'。
11. 可选：为了更好的蛋白质提取，向'核部分'添加25 U /μl的Benzonase核酸酶，并在轨道振荡器上将样品在4°C孵育45分钟。
12. 此时用Pierce TM测定'输入'（~20μg/μl），'胞质组分'（~18μg/μl）和'核组分'（~5μg/μl）的蛋白质浓度 BCA蛋白质分析试剂盒。
13. 安全停止点：在液氮中快速冷冻样品并储存在-80°C直至进一步使用（参见图2，了解分馏步骤的示意图）。
  
  图2.分馏方案的示意图
蛋白质印迹
1. 解冻含有'输入'，'胞质部分'和'核部分'的样品。移取一定体积的样品（所有级分或相同体积的相同蛋白质量）到新的1.5 ml管中。
  注意：当加载相等的体积时，实际上可以比较样品中不同部分之间的特定蛋白质的量。当加载相等的蛋白质量时，可以在条件或蠕虫菌株之间的特定部分内寻找蛋白质的富集。重要的是，始终记下总输入分数的体积和核分数溶解的体积。富集核部分，即以较小的体积溶解沉淀物，增加了蛋白质的浓度，这在免疫印迹期间可能是有用的。然而，在这种情况下，信号不能直接与输入的信号进行比较，因为这部分没有以相同的方式富集。因此，应在之后执行基于所描述的卷的更正。>
2. 加入1/4体积的SDS裂解缓冲液（5x）。
3. 将样品在95℃下煮沸10分钟。
4. 准备12％SDS聚丙烯酰胺凝胶。
5. 将样品和蛋白质标记物加载到12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上。用运行缓冲液填充罐并开始以100V运行，直到样品通过堆积凝胶，然后在120-140V继续，直到染料前端到达凝胶底部。
6. 将凝胶印迹到硝酸纤维素膜上，在转移缓冲液中在95℃下在4℃下湿转移55-60分钟。
7. 在封闭溶液中封闭硝酸纤维素膜1小时。
  可选：将硝酸纤维素膜切割至70 kDa标记以下（LMN-1通常在70 kDa左右，微管蛋白在55 kDa左右）。但请记住您感兴趣的蛋白质的大小。
8. 将膜与适当的抗体在室温下孵育1小时或在4℃下孵育过夜（参见表1）。 LMN-1用作核标记物（~70kDa）和微管蛋白（~55kDa）作为细胞溶质标记物。
9. 用1x PBS-T洗涤膜3×10分钟。
10. 将膜与适当的HRP偶联的二抗在室温下孵育1小时（参见表1）。
11. 用1x PBS-T洗涤膜3×10分钟。
12. 将ECL添加到膜上并使用Las 4000 mini进行印迹。
  可选：当不切割膜时，可以剥离膜并用不同的目标抗体重新探测。

数据分析

图3显示了免疫印迹的一个例子。至少应进行三次独立实验，数据分析的例子可以在Sin et al。>（2017）的图5和S5C中找到。
使用ImageJ通过光密度测定法量化级分水平。有关详细教程，请访问 https://imagej.nih.gov/ij/docs /menus/analyze.html （在“Gels Submenu”下）和 http://lukemiller.org/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-image-j/ 。
＆NBSP;为了计算细胞溶质/输入比，可以针对细胞溶质标记物（α-微管蛋白）的信号对感兴趣的信号进行标准化。核部分是浓缩样本，因此应该使用输入体积和重新悬浮核部分的体积来计算“实际”值。

图3.野生型（N2）蠕虫和蠕虫的亚细胞分离，表达与YFP融合的40个聚谷氨酰胺重复序列（Q40-YFP，AM141）。用α-GFP抗体探测代表性免疫印迹以检测聚谷氨酰胺。 LMN-1（核标记物）和α-微管蛋白（细胞溶质标记物）用作对照。更多的实验细节可以在Sin 等人>（2017）中找到。

食谱

M9缓冲液（1升）
PBS（1升）
PBS-T
含有0.01％吐温20的PBS
阻止解决方案
PBS-T中含5％牛奶
NGM板（1升）

冷却后加入以下缓冲液：
磷酸盐缓冲液1 M pH 6.0（1 L）
低渗缓冲剂
高渗缓冲液
25x蛋白酶抑制剂
溶解1片完全溶于2 ml dH 2 O（-20°C储存）
1 M DTT
将0.154克DTT溶于1毫升dH 2 O（-20°C储存）中
12％丙烯酰胺凝胶（1.0毫米盒式磁带）
运行/转移缓冲区
SDS裂解缓冲液（5x）

致谢

我们感谢Caenorhabditis遗传学中心（由美国国立卫生研究院国家研究资源中心资助）和Mitani实验室的 C.线虫>菌株（由日本国家生物资源项目资助）。该项目由欧洲研究理事会（ERC）资助（EAAN），FundaçãoparaaCiênciaeTecnologia奖学金（SFRH / BPD / 51009/2010）（OS），Ubbo推动的校友章节Gooische Groningers资助。 Emmius Fonds（致EAAN）和格罗宁根大学药物探索研究所（GUIDE）奖学金（OS）。该协议改编自Chen 等人>（2000）和La Rocca 等人>（2007）。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

Barmada，S.J.，Skibinski，G.，Korb，E.，Rao，E.J.，Wu，J.Y。和Finkbeiner，S。（2010）。 TDP-43的细胞质错误定位对神经元有毒，并通过与家族性肌萎缩侧索硬化症相关的突变而增强。 J Neurosci > 30（2）：639-649。
Chen，F.，Hersh，B.M.，Conradt，B.，Zhou，Z.，Riemer，D.，Gruenbaum，Y。和Horvitz，H.R。（2000）。 C的移位。线虫> CED-4在程序性细胞死亡过程中对核膜进行了研究。 Science > 287（5457）：1485-1489。
Kontopoulos，E.，Parvin，J。D.和Feany，M。B.（2006）。 α-突触核蛋白在细胞核中起作用，抑制组蛋白乙酰化并促进神经毒性。 Hum Mol Genet > 15（20）：3012-3023。
La Rocca，G.，Burgio，G。和Corona，D。F.（2007）。来自 D的蛋白质核提取物。 melanogaster >幼虫组织。 Fly（奥斯汀）> 1（6）：343-345。
Sin，O.，de Jong，T.，Mata-Cabana，A.，Kudron，M.，Zaini，MA，Aprile，FA，Seinstra，RI，Stroo，E.，Prins，RW，Martineau，CN，Wang， HH，Hogewerf，W.，Steinhof，A.，Wanker，EE，Vendruscolo，M.，Calkhoven，CF，Reinke，V.，Guryev，V。和Nollen，EA（2017）。鉴定与疾病相关蛋白聚集相关的RNA聚合酶III调节因子。 Mol Cell > 65（6）：1096-1108。