材料和试剂

1毫升一次性注射器（CHIRANA T. Injecta，目录号：CH03001L）
100毫升和500毫升GL45螺纹试剂瓶，包括螺帽（SIMAX，目录号：1632414321100和1632414321500）
50毫升管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
高压灭菌的1.5毫升管（BRAND，目录号：780500）
醋酸纤维素滤膜0.22μm孔径（Frisenette，目录号：CA047022）
一次性丁腈手套
PCR管（VWR，目录号：211-0338）
带屏障的移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，ART TM ）
血清移液器10 ml（Th.Geyer，Labsolute，目录号：7695553）
dsDNA在水或缓冲液NE中稀释至浓度为5 ng /μl（NucleoSpin ®凝胶和PCR清理）（MACHEREY-NAGEL，目录号：740609）
注意：如果需要对DNA进行琼脂糖凝胶纯化，请使用NucleoSpin > ®> 凝胶和PCR纯化来提取DNA （MACHEREY-NAGEL，目录号：740609）。>
冰
100 mM ATP（赛默飞世尔科技，目录号：R0441）
100 mM GTP（赛默飞世尔科技，目录号：R0461）
浓盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：30721-1L）
氯化镁六水合物（Sigma-Aldrich，目录号：M2670-1KG）
氢氧化钠（VWR，目录号：28240.292）
氯化钠（VWR，目录号：27810.295）
Tris（VWR，目录号：103156X）
从PURELAB Chorus 1（Elga Veolia）获得的超纯水18.2MΩ
氯化锌（VWR，目录号：29156.231）
甘油（VWR，目录号：24388.295）
HEPES（VWR，目录号：30487.297）
2μM纯化的cGAS [155-522]库存（参见食谱）＆nbsp;
MgCl 2 （200 mM）（见食谱）
ZnCl 2 （10 mM）（见食谱）
NaOH（5 mM）（见食谱）
Tris（pH 7.5,1 M）（见食谱）
5x反应缓冲液（见食谱）
缓冲液A（见食谱）
缓冲液B（见食谱）
ATP（10 mM）（见食谱）
GTP（10 mM）（见食谱）

设备

用于ÄKTApurifier10的2 ml样品环（GE Healthcare，目录号：18111402）
ÄKTApurifier10（GE Healthcare）
用于PCR管的铝冷却块（例如>，Sigma-Aldrich，目录号：Z740270-1EA）
-80°C冰箱
真空泵＆nbsp;
离心1.5 ml管（Eppendorf，型号：MiniSpin ®，目录号：5452000018）
ÄKTApurifier10注射针（GE Healthcare，目录号：18180142）
实验室天平，可读性为0.001克
用于PCR管的微量离心机（Spectrafuge TM Mini）（Sigma-Aldrich，Labnet International，目录号：S7816EU-1EA）
pH电极（VWR，目录号：662-1157）
pH计（VWR，目录号：662-1421）
Pipetboy
移液器（Finnpipette，Thermo Fisher Scientific）
资源Q 1 ml（GE Healthcare，目录号：17117701）
热循环PCR仪（Bio-Rad Laboratories，型号：T100 TM ）
用于GL45螺纹试剂瓶和47 mm过滤膜直径的真空过滤漏斗，例如>，Nalgene TM 聚砜可重复使用瓶顶过滤器（Thermo Fisher Scientific，目录号：DS0320-5045）

软件

Unicorn 5.11 AA或7（通用电气医疗集团，目录号：28400955或29203853）

程序

注意：在本协议的所有步骤中都应佩戴手套，以保护您的样品免受磷酸酶污染。>

准备对照样品以评估ATP，GTP和cGAMP的质量和洗脱曲线
注意：将此步骤保存在冰上。>
1. 如下所述将ATP样品，GTP样品和cGAMP样品混合在1.5 ml管中。
2. 样品可以储存在-80°C并在离心之前立即解冻，然后在RESOURCE Q 1 ml色谱柱上进行分析（参见程序D）。
稀释DNA片段和制备酶主混合物
注意：＆nbsp; >
1. 此协议中的过程B和C在不暂停的情况下执行。将铝制冷却块置于冰上30分钟，然后启动程序B，并在整个程序B和C中将其保持在冰上。>
2. 在此步骤中将所有物质保存在冰上，将酶混合物混合在冰上，并将酶混合物保持在冰上。>
1. 将您正在测试的DNA片段稀释至浓度为5 ng /μl的超纯水或缓冲液NE中。
2. 根据下表混合酶主混合物以达到所需数量的反应。
  
  注意：＆nbsp; >
  1. 只需通过升级配方，就可以为任何数量的反应准备酶主混合物。强烈建议您制备酶主混合物的剩余物。例如，如果你想进行四次反应，你应该将一个反应的配方乘以五。>
  2. 您将要做的反应数量是您要测试的DNA种类数量加上没有DNA的阴性对照。>
3. 通过使用具有合适体积的移液管小心地上下移液几次，充分混合主混合物。不要引入气泡或泡沫！
体外> cGAS反应
1. 在制备酶主混合物后，立即将每个反应放置一个PCR管进入铝冷却块（记住用于无DNA阴性对照的管）。
2. 移取160μl酶主混合物到每个PCR管中。
3. 将40μl给定的DNA种类/片段（5ng /μl）加入相应的PCR管中，并上下移液10次以确保混合（避免气泡）。
4. 对于阴性对照，添加40μl超纯水或缓冲液NE，具体取决于DNA片段的悬浮状态。
  注意：应尽快将DNA添加到PCR管中，但样品中不会形成泡沫。当样品保存在冰上时，cGAS催化反应没有发生任何明显的程度。>
5. 在小型Spectrafuge TM 上将PCR管离心30-60秒，以除去位于管侧面的任何液滴并除去任何气泡。
6. 将PCR管放回冷却块中。
7. 将T100 TM 热循环PCR机在37℃，10分钟，95℃和12℃下无限期编程为2小时。盖子加热设定为105℃，样品体积设定为最大值（100μl）。
8. 将PCR管转移到PCR机器并启动程序。
9. 当在37℃下2小时和在95℃下10分钟时，将PCR管移至-80℃冰箱，在那里将它们储存直至分析（程序D）。
分析RESOURCE Q 1 ml的样本
注意：一次一个地分析反应。通过继续步骤D3分析在程序A中制备的ATP，GTP和cGAMP样品。>
1. 解冻单个PCR管并将所有200μl转移至1.5ml管中。
2. 将800μl缓冲液A加入1.5 ml管中并充分混合。
3. 将现在稀释的反应样品在12,100 x g >下在4℃下离心15分钟。
4. 准备ÄKTApurifier10和RESOURCE Q 1 ml色谱柱。
  1. 在缓冲液A中清洗泵A，在缓冲液B中清洗泵B.
  2. 清洗整个流路，包括缓冲液A中的2 ml样品环，流速为1 ml / min，直至电导率稳定且低于2.5 mS / cm。
  3. 将RESOURCE Q 1 ml色谱柱连接到系统并平衡缓冲液A中的色谱柱。
5. 将注射针固定在1 ml注射器上，将900μl稀释的反应样品吸入注射器，不要打扰离心后可能出现的颗粒。
6. 将800μl注入样品环。
7. 使用Unicorn软件对ÄKTApurifier10进行编程以执行以下操作（请参阅表S1 为完整变量列表）：
  计划：
  波长1 = 280nm
  波长2 = 254nm
  波长3 = 215 nm（可选）
  流速：0.5 ml / min
  用2个柱体积平衡缓冲液A
  空循环用10毫升
  25个柱体积的0％至50％缓冲液B的线性梯度
  用5％柱体积的100％缓冲液B洗涤柱
  用5个柱体积的缓冲液A重新平衡
  没有分馏
  注意：色谱柱的最大压力为1.5 MPa，但在此应用中色谱柱产生的压力通常小于0.5 MPa。我们在4°C下运行色谱，但它也可以在室温下运行。>
8. 当运行结束时，可以通过重复程序D来分析下一个反应样品。

数据分析

打开Unicorn 5评估窗口（如果您使用的是Unicorn 7，请使用评估经典应用程序）并打开您想要分析的数据（每个阴离子交换层析运行的数据可以在评估左侧的结果导航器中找到窗口）。打开数据后，单击“积分”，然后从下拉菜单中选择“峰积分”。
＆NBSP;将打开一个新窗口。在此窗口中，白色背景上将有两个列表。在左侧列表中选择254 nm UV进行积分（如果程序如补充图1中所述，254 nm UV是顶部的第二个元素，当列表元素以蓝色突出显示时，选择它）。基线应设置为“计算基线”（默认）。单击“确定”，曲线下方将出现一个峰值表。根据保留体积列出鉴定的峰，您可以读取cGAMP峰的曲线下面积（AUC）和色谱图中的任何其他峰。确保计算的基线看起来正确。如果曲线由于系统中的空气或其他伪影而在峰值周围发生突然和不连续的变化，则会产生不可靠的基线和不可靠的结果。如果曲线不连续，可能需要重复实验。
＆NBSP; AUC具有单位mAU•ml，对于cGAMP峰，AUC是从离子交换柱洗脱的cGAMP量的测量值。从柱洗脱的cGAMP的量取决于反应中产生的cGAMP的量。因此，可以使用cGAMP峰的AUC来表示cGAS的活性。例如，AUC可以在列条形图或列散点图中呈现。
注意：可以将cGAMP的定量从mAU•ml转换为nmol。这要求您通过在阴离子交换柱上运行不同浓度的cGAMP来制作cGAMP标准曲线。>
＆NBSP; ATP在电导率约为1时出现峰值。 17.1 mS / cm。电导率约为50时，ADP峰值也可能较小。 13.6 mS / cm。 GTP在电导率约为1时出现峰值。 18.4 mS / cm。电导率约为10时，GDP可能也会出现小峰值。 14.9 mS / cm。 2'3'-cGAMP在电导率约为2时产生峰。 9.9 mS / cm。
在运行之间和ÄKTApurifier系统之间可能存在小的差异。有关代表性数据，请参见图1和Luecke 等人>（2017）。

图1.色谱图示例。 A. 2'3'-cGAMP，ATP和GTP的色谱图。 B和C.两种不同反应的色谱图。 B）具有4kb PCR片段的cGAS。 C）没有DNA的cGAS。该数据先前已在Luecke 等人发表。 >（2017）。

笔记

NTP对去磷酸化非常敏感。因此，保护样品免受环境中的磷酸酶非常重要。这就是为什么在处理或处理样品和试剂时应戴手套的原因。 1.5毫升管应进行高压灭菌，一般应注意不要用磷酸酶污染样品。
＆NBSP;适用于cGAS的其他反应条件也可用于该测定。避免在缓冲液中使用EDTA等螯合剂，因为它们会干扰阴离子交换柱。根据我们的经验，高盐浓度也可以抑制反应。如果增加cGAS和DNA的量，请注意不要遇到底物耗尽。我们建议在终止反应后至少剩余60％的底物

食谱

2μM纯化的cGAS [155-522]库存
将2μM纯化的人cGAS截短至氨基酸155-522，悬浮于70 mM NaCl，10％（v / v）甘油，20 mM HEPES，pH 7.5中。注意：对于cGAS纯化，请参见Luecke等。（2017年）。用编码cGAS [155-522]的pET-21a质粒转化大肠杆菌，所述质粒具有N-末端Hexa His-MBP标签和烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点。融合蛋白由细菌细胞表达，并且在纯化过程中裂解掉MBP标签，在Arg155前面留下四个残基Gly-Ala-Met-Gly。在将浓度调节至2μM之前，透析可用于将cGAS的缓冲液更换为70 mM NaCl，10％（v / v）甘油，20 mM HEPES，pH 7.5。>
MgCl 2 （200 mM）
将2.03 g MgCl 2 •6H 2 O溶于50 ml超纯水中
ZnCl 2 （10 mM）
将0.682g ZnCl 2 溶于500ml超纯水中
NaOH（5 M）
将100g NaOH溶于500ml超纯水中
Tris（pH 7.5 1 M）
1. 将60.57g Tris溶于400ml超纯水中，并在室温下使用浓HCl调节pH至7.5
2. 使用超纯水将体积调节至500毫升
5x反应缓冲液
1. 将1.46g NaCl与12.5ml 200mM MgCl 2，，0.25ml 10mM ZnCl 2，，10ml 1M Tris pH 7.5混合。
2. 使用超纯水将体积调节至50毫升
3. 用0.22μm醋酸纤维素滤器过滤5x反应缓冲液
4. 储存在-20°C
5x反应缓冲液的最终组成为500mM NaCl，200mM Tris，50mM MgCl 2，和50μMZnCl 2 ，pH 7.5
缓冲区A
1. 将10ml 1M Tris pH 7.5与400ml超纯水混合
2. 使用5 M NaOH在室温下将pH调节至7.5
3. 使用超纯水将体积调节至500毫升
4. 用0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤缓冲液
5. 准备新鲜的缓冲液
缓冲液A的最终组成为20mM Tris pH 7.5
缓冲区B
1. 将22g NaCl和10ml 1M Tris pH 7.5与400ml超纯水混合
2. 使用5M NaOH在室温下将pH调节至7.5
3. 使用超纯水将体积调节至500毫升
4. 用0.22μm醋酸纤维素过滤器过滤缓冲液
5. 准备新鲜的缓冲液
缓冲液B的最终组成是750mM NaCl，20mM Tris pH 7.5
ATP（10 mM）
将100μl100mM ATP与900μl超纯水混合
制作适合您要求的等分试样，储存在-80°C
注意：注意不要用手或周围环境中的磷酸酶污染。>
GTP（10 mM）
将100μl100mM GTP与900μl超纯水混合
制作适合您要求的等分试样，储存在-80°C
注意：注意不要用手或周围环境中的磷酸酶污染。>

致谢

我们感谢SørenR。Paludan教授和Stefanie Luecke博士。用于帮助开发本协议中描述的方法。我们感谢Hans Henrik Gad，Ph.D。对手稿的评论。
＆NBSP;这项工作由诺和诺德基金会（NNF17OC0028184）和丹麦独立研究自然科学理事会（4181-00012B）资助。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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