材料和试剂

Flystuff Drosophila >管聚丙烯（Scientific Laboratory Supplies，Flystuff，目录号：FLY1318）
Flystuff棉球（科学实验室用品，Flystuff，目录号：大瓶用于FLY1200，小用于小瓶FLY1028）
飞行太平间（塑料漏斗和塑料烧杯）
薄漆刷
解剖针（Watkins＆amp; Doncaster，目录号：D416）
Pooter（自制）（3毫升刻度巴斯德吸管，6毫米橡胶管，平纹细布）
塑料移液管连接到橡胶管上，细纱作为移液管和管之间的物理屏障。通过橡胶管轻轻吸入，可以将单个苍蝇收集到移液管中。＆nbsp;
聚苯乙烯培养皿，90 mm（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：12654785）
滤纸，90 mm，QL 100（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：11566873）
封口膜
Drosophila melanogaster > - 库存线Oregon-R和Dahomey（布卢明顿股票中心）
二氧化碳，工业级，BOC，40-VK
飞食成分（存放在阴凉干燥处，以最大限度延长保质期，不要保存超过12个月）
活性干酵母，500克（BakeryBits，目录号：BB-1606）
糖蜜＆NBSP;
琼脂（ForMedium，目录号：AGA01）
玉米面/玉米粉
糖
淀粉（Fisher Scientific，Fisherbrand TM ，目录号：S / 7960/60）
灭活啤酒酵母
丙酸（Sigma-Aldrich，目录号：402907）
Nipagin M（Sigma-Aldrich，目录号：H3547）
绝对乙醇（赛默飞世尔科技，目录号：E / 0600DF / C17）
红葡萄汁（BTP Drewitt Ltd.）
糖酵母琼脂（SYA）培养基（见食谱）
玉米面糖蜜酵母（CMY）培养基（见食谱）
淀粉培养基（见食谱）
葡萄汁盘（Purps）（见食谱）

设备

Flystuff Drosophila >玻璃瓶（科学实验室用品，Flystuff，目录号：FLY1086）
锋利的手术刀
带飞垫和枪的Flystuff台式流动伙伴系统（科学实验室用品，Flystuff，目录号：FLY1010）
立体显微镜（Leica Microsystems，型号：Leica MZ75）
Watson Marlow食品分配器（Watson-Marlow Fluid Technology Group，目录号：520Di）
胚胎收集笼大（科学实验室用品，Flystuff，目录号：FLY1214）

软件

R v3.3.2（R核心团队，2017年）
JMating v1.0（Carvajal-Rodriguez和Rolan-Alvarez，2006）

程序

实验设计的图形概述（图1）

图1.方法的视觉摘要。所有果蝇都作为SYA培养基上重叠世代的实验室群体进行维护。通过将果蝇分组到CMY或淀粉日粮上，将这些种群分成两部分，并将这些性别分离的种群与不连续的世代保持在一起。每隔一段时间进行一次配对交配试验，以确定这些种群之间的生殖隔离水平。
CMY和淀粉饮食中蝇类的生成和维持
1. 所有实验和培养均在设定为25℃，50％相对湿度的受控环境室中进行，12小时：12小时白天：夜间循环。＆nbsp;
2. 在大型人口笼中饲养标准糖 - 酵母 - 琼脂培养基（SYA，见食谱）。
3. 将这些起始种群中的果蝇分成两个独立的种群，一种在CMY培养基上饲养（参见食谱），另一种在淀粉培养基上饲养（参见食谱）（图1）。
4. 在200毫升玻璃瓶中保持每条独立系列200名女性和200名男性，用棉花包扎并含有70毫升适当的饮食。＆nbsp;
5. 对于每个离散的一代，麻醉一瓶含有CO 2 的苍蝇，并将苍蝇放在CO 2 垫上。＆nbsp;
6. 使用解剖显微镜识别200只雄性和200只雌性，并使用柔软的画笔将它们转移到新鲜的小瓶中，过量的果蝇应该通过将它们扫入飞行太平间来丢弃。
7. 可以通过各种外部形态鉴定男性和女性。女性有一个尖的腹部，每个腹部都有狭窄的暗带。男性有一个圆形的腹部，最后面的部分几乎均匀地变暗，此外，生殖器的复杂结构是可见的（图2）。男性的另一个特征就是在前腿的第四段（未显示）上称为性梳的短排刷毛（Demerec，1965）。
  
  图2. Drosophila melanogaster的成人形态 > 。从左上方顺时针方向：非翼夹成年女性，翼修剪成年女性，翼夹成年男性，非翼夹成年女性。
8. 成年人可以在被移除前配对，喂食和产卵48-72小时，然后用力敲打瓶底以暂时击晕成年果蝇，取下塞子并将瓶子翻过飞行太平间。再次牢牢地敲打瓶子的底部，成年人将落入太平间，重复此操作直至所有成年果蝇都被移除。将塞子插回瓶中，等待新成人出现（返回步骤B5）。这允许记录离散世代。＆nbsp;
在交配测试之前标准化饲养一代
1. 为了消除任何母体效应或营养对行为的直接影响，苍蝇在相同的日粮和标准化的幼虫密度下进行单代饲养（图1）。
  注意：分离的人群分开维护，所有瓶子和小瓶都清楚地标明了人口来源，饮食治疗和世代数。＆nbsp; >
2. 用CO 2 麻醉每瓶中的成虫，并将雌性转移到具有葡萄汁板（Purp）和活化酵母糊的产蛋室中。
3. 将雌性饲养在产蛋室中1小时，然后重新麻醉成虫并将它们放回原来的瓶子中。
4. 用含有封口膜的新鲜鸡蛋密封培养皿，放置24小时。
5. 24小时后，在解剖显微镜下放置purp平板，用解剖针挑取1只> 龄期幼虫，并转移到具有8ml CMY培养基的玻璃小瓶中。
6. 保持小瓶的固定幼虫密度为每瓶100只幼虫（Horváth和Kalinka，2016）。
7. 每天监测小瓶直到幼虫出现并开始在食物介质上方的玻璃小瓶的内表面上蛹化。
8. 在上述条件下，蛹病例的成虫羽化预计会在3-4天内发生，此时可以收集处女的雄性和雌性。＆nbsp;
收集处女男性和女性
1. 为了收集雄性和雌性进行杂交，收集原始成虫（ ca。> <成虫羽化后6小时）非常重要。
2. 为了确保原始成人的收集，可以通过牢牢地敲击每个小瓶的底部并在飞行太平间上翻（见步骤B5），并且仅在6小时窗口内出现的那些成年人，在早晨第一件事清除成人的小瓶。以下用于交配十字架。＆nbsp;
3. 年轻的处女成年人与老年人不同，因为他们非常苍白，在腹部角质层（胎粪）下可见明显的黑斑。符合此描述的成年人即使在未在6小时窗口内分类的集合中也可以作为处女进行可靠收集（图3）。
  
  图3.处女蝇的胎粪。在羽化后的早些时候，成年果蝇腹部下方会出现一个深绿色斑点（胎粪，最后一餐的残留物）。仍然存在的苍蝇可以作为处女可靠地收集。
4. 在CO 2 下麻醉新生成人的小瓶，并在解剖显微镜下在CO 2 垫上分类成雄性和雌性（参见步骤B5-B7）。＆nbsp;
5. 将雄性和雌性放入单瓶性别小瓶中，每瓶10个成人（每瓶8ml CMY食物）。
6. 交配试验应在羽化后5-7天进行，在此之前24小时，这一半的果蝇将被夹翼，以便在交配时将果蝇混合在一起时可以确定果蝇的背景（见图1和图2）。
7. 用CO 2 麻醉所有苍蝇（为了使处理标准化），用一把锋利的手术刀将一半苍蝇的翅膀尖端夹住。已经证明翼切割不会影响多个研究中的行为或交配，但切割应该在平衡设计中进行，以便切割一半的CMY群体，并且将一半的淀粉群体夹在相同数量的雄性和雌性中＆NBSP;
8. 削减或假处理后，将所有苍蝇归还到他们的小瓶中。＆nbsp;
测试配对交配
1. 交配测试的目标应该是根据苍蝇适应的昼/夜循环，在“开灯”的30分钟内开始。
2. 用于生殖隔离的交配试验以四重设计建立，其中一名男性和女性来自CMY治疗，一名男性和女性来自淀粉治疗。一名男性和一名女性应该被翼夹在身上，并且知道自己的身份（图1）。＆nbsp;
3. 每个配对室都是一个空的玻璃小瓶，除了一条滤纸浸泡在RO水中以提供水分，并用棉绒塞密封。＆nbsp;
4. 将每个处理中的一个雄性动物引入配对室，然后每个处理中一个雌性动物。＆nbsp;
5. 连续监测室，直到第一对苍蝇交配，并记录苍蝇的身份。在研究后2小时内移除任何不会产生配对的配合室。＆nbsp;
6. 任何含有死亡个体的小瓶，不动，或交配一段时间<1小时。在实验过程中5分钟应该被丢弃。＆nbsp;

数据分析

应记录每对交配对中苍蝇的总数（表1），并可绘制为频率条形图。

表1. Dahomey > 的配对数据在Starch和CMY日粮中饲养5,30和35代
跨越多代和/或重复实验的不同交配对的频率的统计显着性可以用R中的“mantelhaen.test”函数计算（如Leftwich et al。> [2017]中所使用的）。
或者，对于每个实验重复，可以计算每对类型的观察数量和总可能数量（观察到配对对的小瓶数量+未观察到交配的小瓶数量）配对数量。这可以使用JMating v1.0计算，以计算对隔离索引（IPSI）。 IPSI在-1到+1之间变化，其中+1表示总的配对交配和-1总的不协调交配。值0将是随机交配。该系数的统计显着性也可以使用10,000次重采样的自举的引导在JMating中计算。

食谱

点胶：使用食品泵分配器，可根据需要将所有介质分配到200 ml玻璃瓶，果蝇瓶或培养皿中。>

糖酵母琼脂（SYA）培养基
一起添加1升媒体
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>琼脂
30克（3％）
糖
50克（5％）
啤酒酵母
100克（10％）
水
1 L ddH _{2 O
将培养基煮10-15分钟直至开始沸腾
在添加防腐剂之前，让介质冷却至60°C以下 class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>丙酸
3毫升（0.3％）
尼泊金M（10％在乙醇中）
30毫升（3％）}
玉米面糖蜜酵母（CMY）培养基
一起添加1升媒体
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>琼脂
10克（1％）
玉米面（玉米）
76克（7.6％）
糖蜜
76克（7.6％）
啤酒酵母
50克（5％）
水
1 L ddH _{2 0 将培养基煮10-15分钟直至开始沸腾
在添加防腐剂之前，让介质冷却至60°C以下 class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>丙酸
2毫升（0.2％）
尼泊金M（10％在乙醇中）
4毫升（0.4％）}
淀粉介质
一起添加1升媒体
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>琼脂
10克（1％）
淀粉
30克（3％）
啤酒酵母
50克（5％）
水
1 L ddH _{2 O
将培养基煮10-15分钟直至开始沸腾
在添加防腐剂之前，让介质冷却至60°C以下 class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>丙酸
5毫升（0.5％）}
葡萄汁盘
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>琼脂
12.5克
红葡萄汁
150克
水
275毫升ddH _{2 O
将培养基煮10-15分钟直至开始沸腾
在添加防腐剂之前，让介质冷却至60°C以下 class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>尼泊金M（10％在乙醇中）
10.5毫升}

致谢

我们要感谢Leonela Z Carabajal Paladino和Wayne Rostant分别为图1和图2提供图像。这是Leftwich et al。>（2017）中描述的协议版本，该协议由生物技术和生物科学研究委员会研究基金BB / K000489 / 1资助（致Tracey Chapman，Philip Leftwich）和马特哈钦斯）。

利益争夺

作者声明没有竞争利益或利益冲突。

参考

Carvajal-Rodriguez，A。和Rolan-Alvarez，E。（2006）。 JMATING：用于分析交配频率数据的性选择和性隔离效应的软件。 BMC Evol Biol > 6:40。
Demerec，M。（1965）。果蝇的生物学。 > CSHL出版社。
Horváth，B。和Kalinka，A。T.（2016）。幼虫拥挤对黑腹果蝇发育时间和活力的定量变异的影响 >。 Ecol Evol > 6（23）：8460-8473。
Leftwich，P。T.，Clarke，N。V. E.，Hutchings，M。I. and Chapman，T。（2017）。在果蝇>中的肠道微生物组和生殖隔离。 Proc Natl Acad Sci USA > 114（48）：12767-12772。
R核心团队。（2017年）。 R：统计计算的语言和环境。< / a> R统计计算基金会，奥地利维也纳。