材料和试剂

1.5毫升和2.0毫升微型离心管（Tarson，目录号：500010和500020）
移液器吸头（10μl）（Tarson，目录号：521000）
移液器吸头（200μl）（Tarson，目录号：521010）
移液器吸头（1,000μl）（Tarson，目录号：521020）
13毫米螺旋瓶（Borosil，目录号：VO04C113005000）
30毫升培养管（Riviera，目录号：71200305）
50毫升猎鹰管（Tarson，目录号：546041）
250毫升锥形瓶（Borosil，目录号：4980021）
塑料托盘（13厘米x 22厘米）
培养皿（90毫米）（Tarson，目录号：460090）
120孔1.5毫升至2.0毫升管架（塔森）
Meta loop（Himedia，目录号：LA650-1）
棉毛（SN手术和保健科学（P）LTD，目录号：DL-160M）
薄纸（Hygienics Plus，目录号：HPTP02）
Ralstonia solanacearum （F1C1）（实验室集合）
番茄种子（杜尔加：选择-22）[杜尔加种子农场（REGD），昌迪加尔，印度]
无菌蒸馏水
蛋白胨（Himedia，目录号：RM001-500G）
酪蛋白氨基酸或酪蛋白酸水解物（SRL，目录号：CI019）
葡萄糖（Himedia，目录号：MB037-500G）
琼脂粉（Himedia，目录号：GMR026-500G）
酵母提取物粉末（Himedia，目录号：RM027-500G）
BG琼脂培养基（见食谱）
BG肉汤培养基（见食谱）
20％葡萄糖补充剂（见食谱）

设备

移液器（Eppendorf-这些移液器可分别容纳10μl，200μl，1,000μl的移液器吸头）
水蒸馏系统（Riveria，目录号：7222010）
高压灭菌器（EquitronMedica，型号：7431PAD）
培养箱和振荡器（28°C）（Scigenics Biotech，Orbitek ®，型号：LE0102DCBA）
宏观离心机（Eppendrof，型号：5804R）
层流气流（Ikon仪器，型号：1K-137）
称重平衡（Mettle Toledo，型号：ME204）
生长室（ScigenicsBiotech，Orbitech ®，型号：GC350）

程序

番茄幼苗的萌发（图1）
1. 取番茄种子，用无菌蒸馏水洗净。
2. 将种子在无菌蒸馏水中在约25至30℃的室温下浸泡48小时（图1A）。
3. 将浸泡过的种子撒在塑料或玻璃托盘上的棉花和纸巾床上，然后将托盘放入保持在28°C，75％RH和12小时光周期的生长室中（灯的光强度为1,350 lm，色温为4,000 K）（图1B）。
4. 在种子萌发期间，通过定期喷洒无菌蒸馏水来保持种床的水分。
  注意：定期喷洒无菌蒸馏水有助于更好的幼苗生长，也有助于防止细菌和/或真菌污染。
5. 挑选具有相似大小的6-7天大的番茄幼苗用于感染测定。
图1.显示用于研究的根接种测定的不同步骤的图片 R.青枯病番茄幼苗的致病性 A.将番茄种子浸泡在无菌蒸馏水中48小时。 B.种子在无菌和湿棉花和薄纸床上的铺展。 C.在28℃和75％相对湿度直至幼苗阶段的生长室中在无菌和湿纸巾床上发芽番茄种子。 D.通过将根浸入细菌接种容器中来对番茄幼苗进行根接种。 E.将每个接种的幼苗转移到无菌的1.5-2ml空微量离心管中。在空气暴露约5分钟后，向每个微量离心管中加入1.0至1.5ml无菌水。 F.接种后约40-48小时，感染的幼苗开始枯萎，表明早期萎the症状。 G.在接种后第7天天，与作为对照的水（底侧）相比，80％至90％的感染番茄幼苗变得永久枯萎并死亡（顶侧）。
细菌接种物制剂
1. 条纹 R.在BG-Agar平板上的青枯菌（）细菌（F1C1）并在培养箱（Orbitek，Scigenics Biotech（Pvt。）Ltd.，India）中培养，保持在28℃下24小时。
2. 添加新鲜种植的 R.将青枯菌（F1C1）菌落到具有无菌环的无菌小瓶中的50ml BG肉汤中，并使其在保持在28℃的振荡培养箱（Orbitek，Scigenics Biotech（Pvt。）Ltd.，India）中生长。 150转/分钟，24小时。
3. 将完全培养的细菌培养物在4,000rpm（3,155 x g ）下于4℃离心15分钟，然后弃去上清液。
4. 将细菌沉淀重悬于无菌蒸馏水中并重复步骤B3（在4℃下以4,000rpm [3,155 xg ]离心15分钟）以从悬浮液中除去剩余的培养基组分。
5. 现在将细菌沉淀重悬于等体积的无菌蒸馏水中，以获得~10 9 CFU / ml的浓度。现在，这种细菌接种物已准备好感染。
接种 R. 6-7days番茄幼苗中的茄科（图2）
1. 从发芽床中挑选6-7天大的番茄幼苗，大小相近。
2. 将5-20ml细菌接种物加入宽口容器中。
3. 将幼苗根部浸入细菌接种物中直至根部连接处几秒钟。
4. 现在将这些幼苗转移到空的无菌微量离心管（1.5或2.0ml）管中。
5. 然后空气使幼苗暴露约5分钟（这里“空气暴露”意味着将病原体接种的幼苗放入无菌空的微量离心管中约5分钟，然后向管中加水）。＆nbsp;
6. 将1至1.5毫升无菌蒸馏水加入含有空气暴露幼苗的微量离心管中。＆nbsp;
7. 以无菌蒸馏水作为阴性对照以相同方式接种幼苗。
8. 将所有接种的以及对照幼苗转移至维持在28℃，75％RH和12小时光周期的生长室中。
9. 从第二天开始直至接种后第7天天开始感染和疾病进展分析。
图2. R中番茄幼苗根接种的示意图。 solanacearum 致病性测定。在这里，我们代表了致病性测定的自解释示意图，以便于更好地理解测定的关键步骤。

数据分析

在这项工作中，我们成功地描述了一种简单有效的方法研究 R的细节。青枯菌早期幼苗期的致病性。所描述的测定非常可重复并且适合于分析不同种类的突变基因功能，包括 R中的微小毒力功能。雷尔氏菌。
＆NBSP;除此之外，在感染测定期间，我们观察并首次报道了 R上有趣的空气影响（空气暴露的病原体接种的番茄幼苗显示出与未暴露的相比更具侵略性和一致的疾病进展）现象。青枯菌对番茄幼苗根系接种的致病性。细菌接种后，番茄幼苗在48小时内出现萎and症状，接种后7天内完全枯萎。该接种方法模拟由该枯萎病原体引起的自然感染模式。考虑到这种根灌培法在番茄早期育苗过程中的重现性和有效性，有助于科学界研究 R期间植物 - 微生物相互作用的毒力行为，寄主适应性以及许多其他基本方面。 solanacearum 感染和疾病进展。
＆NBSP;关于数据处理，统计分析以及重复和独立实验细节的所有其他所需信息已经包含在原始研究论文Singh 等人（2018）中。

笔记

由于番茄种子萌发不是100％有效，因此在设计实验时应考虑到这一点。
在开始采摘番茄幼苗进行根接种之前，在发芽床中加入一定量的水，这将有助于顺利采摘，并最大限度地减少根苗的伤害或破损。
尽管我们已经保持约5分钟的空气暴露以获得更好的感染结果，但接种后空气暴露几分之一也足以诱发疾病症状。
该试验在非致病性细菌菌株接种的帮助下以及 R的不同突变体衍生菌株中得到验证。 solanacearum （F1C1），如 hrpB ， phc A 和 pilT 。之后，通过GUS染色和mCherry-荧光也证实了接种和枯萎幼苗内的进一步细菌定殖研究（Singh 等，，2018）。
所有这些细菌接种和感染步骤均在实验室内的清洁和表面消毒的工作台上进行。对于感染和致病性测定步骤，不需要具有层流的无菌罩。

食谱

BG-Agar，pH 6.5-7（100 ml）
1克蛋白胨
0.1克酪蛋白氨酸
0.1克酵母提取物
1.5克琼脂
加入蒸馏水至100毫升，并在121°C（249°F）高压灭菌培养基约15-20分钟
向其中补充500μl的20％葡萄糖并倒入无菌培养皿中，使板完全固化
BG-Broth，pH 6.5-7（100 ml）
1克蛋白胨
0.1克酪蛋白氨酸
0.1克酵母提取物
加入蒸馏水至100毫升，并在121°C（249°F）下将培养基高压灭菌约15-20分钟。向其补充500μl的20％葡萄糖
20％葡萄糖补充剂（5毫升）
1克葡萄糖
加入蒸馏水至5毫升，并在121°C（249°F）高压灭菌约15-20分钟

致谢

Niraj Singh非常感谢印度政府DBT（DBT-JRF＆amp; SRF）。 Rahul Kumar感谢CEFIPRA和CSIR，政府。印度的博士后奖学金。 Suvendra Kumar Ray感谢CEFIPRA的印度 - 法国项目拨款（4800-B1）。除此之外，S.K. Ray的实验室研究也得到了各种部门项目的支持，如UGC-SAP（DSR II），DST-FIST和DBT-Reinfor NE。我们还要感谢法国LIPM的S. Genin，印度IIT-Guwahati的L. Saho，以及实验室成员Anjan Barman，Tarinee Phukan，Pankaj Losan Sharma，Ruksana Aziz和Kristi Kabyashree的协调和友好支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突。

参考

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