材料和试剂

标准移液器吸头，容量为10μl，20μl，100μl，200μl和1,000μl（Thermo Fisher Scientific，目录号：2140,2149P，ART 10REACH，ART 20P）
Kimwipe废纸S-200（Crecia，目录号：62011）
12毫米直径无涂层盖玻片（Matsunami Glass，目录号：C012001）
24孔板（Greiner Bio-One，细胞培养多孔板，目录号：66）
染色罐（Matsunami，目录号：13号BT500）
Dako Pen（Daido Sangyo，PAP-SPAP Pen Super-Liquid Blocker）
血清移液器
滑动眼镜
NSCLC细胞系：H1975细胞
Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 medium（Invitrogen，Gibco，目录号：61870-036）
Dulbecco的改良Eagle's培养基（DMEM）（Invitrogen，Gibco，目录号：12634010）
胎牛血清（FBS）（西格玛，目录号：14C438FBS）
青霉素/链霉素溶液（Invitrogen，目录号：15140122）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（LSI，目录号：RM102-PN）
PBS中4％多聚甲醛（Wako，目录号：16320145）
ImmunoSaver（Wako，目录号：9706192）
Duolink ® 原位寡核苷酸PLUS（-20°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92009）
Duolink ® 原位寡核苷酸MINUS（-20°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92010）
共轭缓冲液（-20°C）（西格玛奥德里奇，目录号：DUO92009）
停止试剂（-20°C）（西格玛奥德里奇，目录号：DUO92009）
储存溶液（-20°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92009）
20x分析试剂（-20°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92009）
封闭溶液（4°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92009）
PLA探针稀释剂（4°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92009）
兔EGFR单克隆抗体（Abcam，目录号：ab52894）
5x连接缓冲液（-20°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92008）
1x Ligase（-20°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92008）
5x扩增红（-20°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92008）
1x聚合酶（-20°C）（Sigma-Aldrich，目录号：DUO92008）
带有DAPI的Duolink ® 原位封固剂（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82040）
10％中性缓冲福尔马林
石蜡
二甲苯
乙醇溶液
指甲油
文化媒体（10％FBS）（见食谱）
洗涤缓冲液A（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82049，参见食谱）
洗涤缓冲液B（Sigma-Aldrich，目录号：DUO82049，参见食谱）

设备

手动移液器：10μl，20μl，100μl，200μl和1,000μl（Mettler Toledo，目录号：Pipet-Lite XLS + 17014409,17014412,17014408,17014411,17014407）
镊子
冰箱
Direct-Q ® 5 UV远程净水系统（Merck，型号：Direct-Q ® UV 5 Remote，目录号：ZRQSVR5WW）
高压灭菌器（Tomy，目录号：LSX-500）
涡旋混合器（科学工业，型号：Vortex-Genie 2，目录号：S1-0286）
湿度室（孵化室，Cosmo Bio，目录号：10DO）
酶冻结块（-20°C）（Eppendorf，目录号：3880001018）
荧光显微镜（Keyence，型号：BZ-8100）

软件

BZ分析仪软件（Keyence）
Excel（微软）
GraphPad Prism 5.0（GraphPad软件）

程序

注意：所有程序都是针对四个样本执行的。

细胞的制备（图2）
1. 将12毫米直径的盖玻片放入24孔板的每个孔中。
2. 在盖玻璃上，在500μl推荐的培养基中，在37℃，5％CO 2 下使细胞生长至60％汇合。
3. 从孔中取出培养基，每次用1 ml PBS洗涤两次。＆nbsp;
4. 在室温下加入500μl4％多聚甲醛15分钟。
5. 从孔中取出溶液，用1ml PBS洗涤两次。
6. 用镊子从井中取出盖玻片。
图2.使用细胞系制备PLA方法。 A.在平板的每个孔中盖上眼镜（左）。细胞在培养基中的盖玻片上生长（右）。 B.使用DAPI安装盖玻片并用指甲油密封的后PLA载玻片。
制备肿瘤标本
1. 将手术标本固定在10％中性缓冲福尔马林中，将其嵌入石蜡中，切片厚度为4μm。
2. 用二甲苯除去石蜡，用分级系列的乙醇溶液再水化，并用PBS洗涤两次。
3. 将300μlImmunoSaver添加到染色罐中的60ml Milli-Q水中。
4. 将载玻片在98℃下在染色罐中高压灭菌45分钟并在室温下孵育。
5. 用PBS洗涤载玻片两次。
6. 用Dako Pen在约1 cm 2 的肿瘤标本周围画一个圆圈。
PLA寡核苷酸与抗体的缀合
1. 在室温下解冻缀合缓冲液并涡旋。
2. 将2.1μl缀合缓冲液加入21μl兔单克隆抗EGFR抗体中，并用移液管轻轻混合。
3. 将来自步骤C2的抗体溶液转移至一小瓶寡核苷酸PLUS或寡核苷酸MINUS，并用移液管轻轻混合。
4. 在室温下孵育过夜。
5. 涡旋停止试剂溶液并将2.1μl加入到步骤C3的溶液中并在室温下孵育30分钟。
6. 涡旋储存溶液，向步骤C5中制备的溶液中加入25.2μl，并在4℃下储存。
7. 存储的解决方案可在一个月内使用。
封锁
1. 涡旋阻断溶液并将40μl转移至每个样品。
2. 将载玻片放入预热的湿度室中，在潮湿的37℃，5％CO 2 培养箱中孵育30分钟。
解放军探测器
1. 稀释PLA探针稀释液中步骤C6的缀合抗体。
  1. 通过混合10μl20x储备溶液和190μlPLA探针稀释剂制备200μl1x工作分析试剂。
  2. 将8μlPLUS或MINUS抗体溶液（步骤C6）加入72μl工作测定试剂（来自步骤E1a）并在室温下孵育20分钟。
2. 使用Kimwipe废纸板轻轻地从样品中取出封闭溶液，不要接触细胞。
3. 在总稀释PLA探针PLUS溶液和MINUS溶液中加入38μl（19μlPLUS探针和19μlMINUS探针）至每个样品。
4. 用移液管轻轻混合。
5. 在室温下在湿度室中孵育2小时。
结扎
1. 在124μlMilli-Q水中稀释32μl连接缓冲液（5x）并混合。
2. 使用Kimwipe废纸片轻轻地从样品中取出PLA探针溶液，不要接触细胞。
3. 在500μl洗涤缓冲液A中轻轻洗涤载玻片两次，每次5分钟。
4. 将4μl连接酶添加至156μl连接缓冲液（1x）并涡旋。
5. 每个样品中加入39μl溶液。
6. 将载玻片放入预热的湿度室中，在潮湿的37℃，5％CO 2 培养箱中孵育30分钟。
放大
1. 在126μlMilli-Q水中稀释32μl扩增红色（5x）并混合。
2. 使用Kimwipe废纸片轻轻地从样品中取出连接溶液，不要接触细胞。
3. 在500μl洗涤缓冲液A中轻轻洗涤载玻片两次，每次2分钟。
4. 将2μl聚合酶溶液加入158μl扩增红（1x）并涡旋。
5. 每个样品中加入39μl溶液。
6. 将载玻片放入预热的湿度室中，并用加湿的37℃，5％CO 2 培养箱孵育30分钟。
准备成像
1. 使用Kimwipe废纸片轻轻地从样品中取出扩增聚合酶溶液，不要接触细胞。
2. 在500μl洗涤缓冲液B中轻轻洗涤载玻片两次，每次10分钟。
3. 在500μl0.01x洗涤缓冲液B中轻轻洗涤载玻片1分钟。
4. 将载玻片在室温下在黑暗中干燥。
5. 使用最小体积的Duolink ® 原位安装介质和DAPI，用盖玻片安装载玻片。
6. 用指甲油密封边缘，在室温下避光孵育15分钟。
用显微镜成像
1. 使用荧光显微镜分析图像。
2. 成像后，将载玻片保存在-20°C的黑暗中。

数据分析

用Keyence BZ-8100荧光显微镜检测PLA信号（图3）。＆nbsp;
PLA信号作为红色斑点可见，并且在NSCLC细胞中以依赖于PLUS和MINUS探针的添加的方式检测，表明存在EGFR同型二聚体。＆nbsp;
细胞核用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染成蓝色。＆nbsp;
通过使用BZ Analyzer软件计算20个细胞中的红点数来量化每个细胞的PLA信号数量。

图3.通过PLA检测NSCLC细胞系和切除标本中的EGFR同源二聚化。 H1975细胞（A）和肺腺癌手术标本（B）中EGFR同型二聚体的代表性图像。 Ota 等人提供了阳性和阴性对照（2017）。用粉红色线包围的肿瘤细胞通过分析软件计算每个细胞的红色斑点数（B）。比例尺=20μm。

笔记

在添加缀合缓冲液之前，一抗的浓度理想地大于1mg / ml，并且应该至少高于用于免疫组织化学的浓度。
允许来自任何动物的抗体，我们使用兔抗体。
所有使用检测试剂的试验（从程序G开始）都在暗室中进行。

食谱

文化传媒（10％FBS）
1. 开放式液体DMEM或RPMI瓶（500 ml）
2. 用无菌血清移液管取出55毫升，弃去液体
3. 用无菌血清移液管加入50ml FBS
4. 加入5毫升青霉素/链霉素溶液
5. 储存在4°C
洗涤缓冲液A
将一个小袋中的内容物溶解在纯水中至最终体积为1,000ml并储存在4℃
洗涤缓冲液B
将一个小袋中的内容物溶解在纯水中至最终体积为1,000毫升，并储存在4°C

致谢

我们感谢Akiko Sato的技术支持。我们感谢Edanz Group的Sarah Williams博士（ www.edanzediting.com ）编辑本稿件的草稿。这项工作部分得到了JSPS KAKENHI Grant No. JP18K15927的支持。

利益争夺

没有披露潜在的利益冲突。

参考

Duolink ® 原位 - 荧光用户指南。 Sigma-Aldrich公司。（2018年7月4日访问， https://reedd.people.uic.edu/ReedLabPLA。 PDF格式。）
Duolink ® In Situ - Probemaker用户指南。 Sigma-Aldrich公司。（于2018年7月4日访问， https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/Instructions/1/duolink-probemaker-user-manual.pdf。）
Nagai，Y.，Miyazawa，H.，Huqun，Tanaka，T.，Udagawa，K.，Kato，M.，Fukuyama，S.，Yokote，A.，Kobayashi，K.，Kanazawa，M。和Hagiwara，K 。（2005）。快速揭示的非小细胞肺癌细胞系中表皮生长因子受体的遗传异质性和灵敏检测系统，肽核酸锁定核酸PCR钳。 Cancer Res 65（16）：7276-7282。
Ota，K.，Harada，T.，Otsubo，K.，Fujii，A.，Tsuchiya，Y.，Tanaka，K.，Okamoto，I。和Nakanishi，Y。（2017）。使用邻近连接试验可视化和定量表皮生长因子受体同源二聚化和活化。 Oncotarget 8（42）：72127-72132。