材料和试剂

96孔聚丙烯1.2毫升簇管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS4401-960EA）
Corning TM 6孔板（Thermo Fisher Scientific，目录号：07-200-83）
Corning TM 10 ml移液器（Thermo Fisher Scientific，目录号：07-200-574）
15毫升管（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-565-268）
仙台病毒（ATCC，目录号：ATCC VR-105）作为阳性对照
HyClone ®表征胎牛血清，美国原产地（GE Healthcare Life Sciences，目录号：SH30071.03HI）
Gibco TM 庆大霉素，10 mg / ml（Thermo Fisher Scientific，目录号：11500506）
L-谷氨酰胺，200 mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：A2916801）
LLC-MK2原件（ATCC，目录号：CCL-7）
注意：将这些细胞维持在含有5％胎牛血清，20μg/ ml庆大霉素和2mM L-谷氨酰胺（完全培养基199）的培养基199（Thermo Fisher Scientific，目录号：11150-067）中。 LLC-MK2细胞应仅使用至50左右。随着细胞系的老化，斑块将逐渐变小。
Alsevers中的豚鼠血（Rockland抗体和检测，目录号：R305-0050）
注意：这需要不到2周的时间。
中等199（10x）（Thermo Fisher Scientific，目录号：11825015）
中等199（1x）（赛默飞世尔科技，目录号：11150067）
HBSS，钙，镁（赛默飞世尔科技，目录号：14025092）
碳酸氢钠7.5％溶液（Thermo Fisher Scientific，目录号：25080094）
BD Difco Agar（Fisher Scientific，目录号：DF0812-17-9）
胰蛋白酶（0.25％），酚红（Thermo Fisher Scientific，目录号：15050065）
注意：最终浓度为0.00025％（2.5μg/ ml）。该试剂需要针对特定批次进行优化。 2.5μg/ ml±0.25μg/ ml可以区分漂亮的大斑块和从平板上脱落的细胞。
无菌PBS（Ca 2 + 和Mg 2 + ）
青霉素 - 链霉素（5,000 U / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15070063）
完成2x中等（见食谱）

设备

多通道移液器（Gilson，目录号：FA10015）
移液器，P20，P200，P1000（Gilson，目录号：F167300）
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，目录号：1305）
组织培养箱（37°C，5％CO 2 ）（Thermo Fisher Scientific，目录号：51025983）
100毫升玻璃瓶（Research Products International，目录号：219510）
精密 TM 通用水浴（Thermo Fisher Scientific，目录号：TSGP02）
高压灭菌器（Steris Amsco Eagle，目录号：3021-C重力蒸汽灭菌器）
声波水浴（Skymen清洁设备，型号：JP-008）
涡旋混合器（国际研究产品，产品目录号：155560）
便携式迷你灯箱，台式光源（国际研究产品，产品目录号：815500）

程序

天-5到-2
将LLC-MK2细胞种入必要数量的6孔板（如下所示），以便在所有需要的稀释度下测试样品和对照。

注意：您希望第0天（图1）的平板具有轻微融合的细胞。

图1.轻度融合的LLC-MK2细胞。一旦覆盖的琼脂凝固，细胞就不能再增殖。因此，当您在细胞上叠加琼脂时，细胞想要融合（比例尺=100μm）。

第0天

在100ml玻璃瓶中放置无菌50ml琼脂溶液，用于步骤3f
1. 在100ml瓶中加入0.5g琼脂至50ml蒸馏水中。需要一到四瓶。
2. 将瓶子在121℃下高压灭菌30分钟。
3. 将琼脂从高压灭菌器中取出时将其混合均匀，并保持在50℃水浴中直至准备使用（步骤3f）。
注意：最终的100毫升将同时最舒适地处理8个六孔板。最多可容纳4瓶和32块板。
病毒制剂
1. 在冰上解冻病毒样本和阳性对照（待滴定），并将它们保存在冰上。
  注意：为了进行适当的分析，每个实验都需要阳性对照（仙台病毒，来自ATCC的VR-105）。来自ATCC的一个小瓶（1ml）可用于10至20次实验。来自ATCC的小瓶应在第一个实验中等分为50μl至100μl（10至20个管），并储存在液氮罐中。根据我们的经验，通过该方法，病毒滴度至少稳定三年。我们建议您使用来自ATCC的原始SeV（不是“自制的”SeV原液）作为阳性对照，因为病毒滴度的确定性。
2. 在室温下在声波水浴中超声处理（40kHz频率和35W超声功率）病毒样品30秒，然后用于破坏和分离病毒块。
3. 在完全对数（10倍）稀释或半对数（3.16倍）稀释的适当范围内，在纯培养基199（不含胎牛血清，庆大霉素或L-谷氨酰胺）中连续稀释病毒（图2）。使用多通道移液器在96微管（1.2 ml体积）的架子中进行这些稀释将大大提高效率。将样品和稀释液保存在冰上。
  注意：“Pure Medium 199”仅指不含血清的Medium 199（Thermo Fisher Scientific）。
  
  图2.病毒样品的系列稀释液。：一种。对于全对数稀释，将100μl样品连续转移至含有900μl纯培养基199的下一个管中.B。对于半对数稀释，将316μl样品连续转移至含有684的下一个管中。 μl纯培养基199。
接种和孵化
1. 用HBSS和Ca 2 + Mg 2 + 轻轻冲洗板上LLC-MK2细胞的汇合单层：去除旧培养基并加入2 ml含Ca 2 + 镁 2 + 。
2. 从多个平板吸出培养基，并快速向每个孔中加入200μl纯培养基199。
3. 一式两份或一式三份加入200μl样品稀释液。从最稀释到最小稀释工作以节省尖端变化。
4. 将板在37℃下用5％CO 2 孵育90分钟。
  注意：每30分钟轻轻搅拌一次，以避免干燥板。
5. 在孵育期间，以50ml等分试样制备完整的2x培养基（参见食谱）。
6. 在90分钟孵育结束时，将完整的2x培养基（在室温下）和1％琼脂水（在50°C水浴中）混合，用于第一组8个培养板，并将混合物置于室内温度。
7. 从平板吸入病毒接种培养基，并使用10ml移液管（容量12ml）快速将2ml含有0.5％琼脂的培养基（步骤3f）加入每个孔中。
8. 在室温下冷却直至琼脂培养基固化。不要堆叠板。
9. 将平板（用琼脂培养基覆盖的细胞）在37℃，5％CO2下孵育3天。

第3天： Hemadsorption

在15ml管中用无菌PBS（含有Ca 2 + 和Mg 2 + ）洗涤约3ml豚鼠血液3次。在434 x g 旋转5分钟以获得约1ml的红细胞（RBC）沉淀。
将1ml RBC沉淀重悬于含有PBS的9ml PBS（10％体积/体积）中（Ca 2 + 和Mg 2 + ）。
从10％RBC悬浮液中用PBS（具有Ca 2 + 和Mg 2 + ）制备0.1％RBC悬浮液。
从培养箱中取出6孔板，分成小组（如4块板）。
将手腕快速拍打到生物危害袋中，同时将琼脂从一个平板上摇下，然后立即加入2毫升PBS（C a 2 < / sup> + 和Mg 2 + ;室温下）。
注意：去除琼脂会使平板非常干燥并且细胞容易受损（LLC-MK2细胞对脱离不是特别敏感，但这是该测定的效果）。请立即轻轻地沿着孔壁添加PBS，而不是直接添加到细胞中。
从6孔板中取出PBS，并向每个孔中加入2ml 0.1％RBC溶液（步骤3）。
在室温下孵育平板20-30分钟。
轻轻搅动平板重悬RBC，并用2 ml PBS替换RBC悬浮液（Ca 2 + 和Mg 2 + ）。
注意：这种一次性洗涤通常就足够了，但第二次洗涤是可以接受的。
将斑块评为红细胞附着的明确区域（图3）。
注意：在计数前用酒精清洁井底（外部）。如果将平板放在灯箱上，您将能够更容易地识别斑块。
根据样本量（200μl）和稀释度计算pfu / ml。

图3.仙台病毒斑块。 A.一个孔中有五个斑块。 B.一块牙菌斑放大显示附着在LLC-MK2细胞上的红细胞环形斑块和LLC-MK2细胞死亡和脱落的中央空区。

滴度计算的一个例子
如果图3中的接种样品是10 7 稀释度：
病毒滴度（pfu / ml）= 5（噬菌斑）/ [0.2ml（接种体积）×10 7 （样品稀释）] = 2.5×10 8 PFU / ml

笔记

该协议需要适当的设施（生物安全级别2）和经批准的机构生物安全委员会（IBC）协议。

食谱

完成2x中等
注意：所有组件在混合前都需要无菌。

致谢

Yamashita博士得到美国心脏协会科学家发展基金会（17SDG33660947）和加州大学洛杉矶分校临床和转化科学研究所基金（ΜL1TR001881）的支持。我们要感谢Steven Emancipator博士在Yamashita博士职业发展早期的指导和John Nedrud博士之前的合作。

利益争夺

作者没有任何潜在的利益冲突或竞争利益申报。

参考

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