材料和试剂

移液器吸头
显微镜玻璃载玻片25 x 75 mm x 1 mm厚（例如，Thermo Scientific，目录号：421-004T或同等产品）
玻璃盖玻片，圆形，18 mm，＃1（例如，Thermo Scientific，目录号：11709875或同等产品）
1.7毫升塑料管
15毫升塑料管
无核酸酶屏障提示（10μl，200μl，1,000μl）
杂交室（例如，封闭的塑料盒，15厘米的组织培养皿，培养皿）
Parafilm（Bemis，目录号：PM996）
Kimwipes（例如，KCWW，Kimberly-Clark，目录号：34120或同等学历）
12孔板（例如，Costar，目录号：3513或同等产品）
铝箔
感兴趣的贴壁细胞（例如，小鼠胚胎成纤维细胞[MEF]，胃癌NCI-N87细胞）
合适的培养基和补充剂（例如，补充有10％FBS和青霉素/链霉抗生物素蛋白的DMEM）
（可选）细胞外基质底物，例如，纤维连接蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：F1141-5mg）
70％乙醇
无菌PBS x1 pH 7.4，无钙，无镁（例如，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10010-015或同等产品）
10x PBS，无钙，无镁（例如，Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14200-067或同等产品）
MgCl 2 （例如，Sigma-Aldrich，目录号：M8266-100G或等同物）
甘氨酸（例如，Sigma-Aldrich，目录号：G8898-500G或同等物）
32％多聚甲醛（PFA）（电子显微镜科学）
Surfact-Amps TM X-100（Triton X-100）10％溶液（Thermo Scientific，目录号：28314）
注意：这种高纯度的Triton X-100效果最佳，但其他Triton X-100产品将提供令人满意的效果。
20x盐水 - 柠檬酸钠（SSC）缓冲液（例如，Sigma-Aldrich，目录号：S6639-1L或同等物）
Formamide（Sigma-Aldrich，目录号：47671-250ml或同等产品）（保持在4°C）
硫酸葡聚糖（Sigma-Aldrich，目录号：D6001或同等学历）
电子。大肠杆菌 tRNA（100 mg）（Roche，目录号：10109541001）（保持在-20°C）
牛血清白蛋白（BSA）（20 mg / ml）（罗氏，目录号：10711454001）（保持在-20°C）
钒核糖核苷复合物（VRC）200 mM（例如，Sigma-Aldrich，目录号：94742-1 ml或等同物）（保持在-20°C）
不含核酸酶的水
DAPI（核染色）（例如，Sigma-Aldrich，目录号：D9542-1mg或等同物）
荧光寡核苷酸探针组（例如，针对人HER2-Quasar570的Stellaris探针（Biosearch技术，DesignReady目录号：VSMF-2102-5）（参见程序A设计和生产探针）（保持 - 20°C）
抗褪色试剂（例如，来自Thermo scientific的ProLong抗褪色系列）
（可选）高品质指甲油（例如，Electron Microscopy Sciences，目录号：72180）
浸油1.518，适用于显微镜/物镜
PBSM缓冲区（参见食谱）
固定缓冲液（见食谱）
淬火缓冲液（见食谱）
透化缓冲液（见食谱）
预杂交（Pre-hyb）缓冲液（参见食谱）
杂交缓冲液（见食谱）（保持在-20°C）
杂交室（见食谱）
DAPI染色溶液（见食谱）（保持在4°C）

设备

移液器（推荐：S1移液器，Thermo Fisher Scientific，目录号：9501）
镊子，直的，尖的，不锈钢尖端（例如，Ideal-Tek，目录号：4 SA或等效物）
（可选）真空疏水阀＆nbsp;
化学（油烟）罩
生物罩/生物安全柜（用于细胞培养工作）
适合您选择的细胞培养的细胞培养箱（例如，37°C，5％CO 2 ）
37°C培养箱（例如，用于培养细菌板的培养箱）
用于载玻片的纸板托盘（例如，Thermo Fisher Scientific，目录号：12-587-10）
宽视场荧光显微镜（例如，Olympus，型号：BX-61;尼康，型号：Eclipse Ti-E倒置荧光显微镜或Zeiss，型号：AxioObserver Z1）配备以下产品：
1. 荧光光源[例如，Illuminator HXP 120 V光源（Carl Zeiss，型号：Illuminator HXP 120 V）或X-cite 120 PC灯（Excelitas Technologies，X-Cite ® 120PC）]
2. 适用于荧光团的过滤器组件+ DAPI（蓝色）过滤器
3. 自动电动平台，用于 X ， Y 和 Z 轴的亚微米运动[例如，MS 2000 XYZ 自动化阶段（ASI，型号：MS 2000）或电动 XYZ 扫描阶段，130x100 PIEZO（蔡司，产品目录号：432027-9001-000）]
4. Plan-Apo 100x（首选）或63x油浸物镜，具有高NA（1.35 NA或更高）
5. CCD或sCMOS高分辨率数码相机[例如，Flash 4 sCMOS（Hamamatsu）或Pixis 1024 CCD相机（Photometrics）]
6. 适用于控制显微镜（根据制造商）的软件，用于多个通道的自动成像，多个 z - 堆叠和多个区域（例如，MetaMorph，ZEN2，μmanager）
能够进行图像处理的计算机（强大的CPU，至少32 GB RAM）
数据存储计算机
计算机或外部驱动器上的数据存储，允许存储10 GB和最多TB的累积图像数据。

软件

MATLAB-R2015a版本或更高版本＆nbsp;
FISH-quant（Mueller et al。，2013; Tsanov et al。，2016）（自由软件 https://bitbucket.org/muellerflorian/fish_quant ）
ImageJ / FIJI（Schindelin et al。，2012）（免费软件 https://imagej.net/斐济）
Stellaris FISH探针设计师（ https://www.biosearchtech.com/支持/工具/设计软件/ Stellaris的探头设计师）;需要用户帐户（免费）＆nbsp;
Excel或同等程序

程序

寡核苷酸探针的设计和标记
1. 探针是18-22聚体DNA寡核苷酸，其在一端或两端用荧光有机染料荧光标记。最常用的染料是花青（Cy），Alexa和Atto染料系列。为了设计探针，首先获得目的RNA序列。
  注意：为了获得良好的信噪比（SNR），可以检测背景中的FISH斑点，建议每个转录本使用至少25个探针（最佳= ~48个探针），这意味着短转录本（即，<~500nt）可能不适合这种版本的smFISH。替代方法如smiFISH（Tsanov等，2016），RNAscope（Wang等，2012）或clampFISH（Rouhanifard等，2018; preprint），其增强FISH信号，可能更适合短RNA。＆NBSP;
2. 我们建议使用Stellaris探针设计网络工具。插入有义链序列并选择所需参数（即，生物体，特异性水平，探针数，探针长度和最小间距）。我们建议选择最高水平的特异性，即，5和48个20 nt探针，默认为2 nt间距。如果有＆lt; 25个探头，参数可以更改，直到您满意为止。
3. 标签探针有多种协议。最简单的解决方案，我们建议一致性和易用性，是从Biosearch技术订购Stellaris RNA FISH探针（ https：// www.biosearchtech.com/ ）。但是，这些都相对昂贵。一种替代方案是用胺末端命令DNA寡核苷酸并用胺活性染料标记（Singer，1998）。请注意，此协议适用于50 nt寡核苷酸，但可用于20 nt寡核苷酸。此方法效果很好，但仍然相对昂贵。更便宜的选择是酶标记探针（Gáspár et al。，2017和2018）。＆nbsp;
4. 寡核苷酸探针组应悬浮在无核酸酶的水中（对于Stellaris探针，制备25μM溶液）并在-20℃避光保存。探针可分为10-20μl的等分试样，以避免多次冻融循环（尽管根据我们的经验，我们在多次冻融循环后未检测到任何明显的变质）。
细胞培养
一般评论：＆nbsp;
1. 在生物安全柜（生物罩）中进行无菌细胞培养工作。
2. 此协议专为贴壁细胞而设计。对于非贴壁细胞，需要添加额外的步骤以将细胞粘附到盖玻片上。规划此类步骤的用户需要考虑以下几点：＆nbsp;
  1. 如何将细胞粘附在玻璃上（例如，通过聚赖氨酸涂层）？＆nbsp;
  2. 决定在固定之前还是在最后的洗涤步骤之后将细胞粘附到玻璃上。每种情况都需要不同的方案步骤（例如，要么在盖玻片上或在管中进行洗涤，要么在坚持之前或之后进行固定），甚至可能产生不同的结果。＆nbsp;
  3. 校准每个盖玻片的细胞数。＆nbsp;
3. 如果可能，建议添加额外的细胞系作为所用FISH探针的阴性对照（例如，敲除细胞，表达目标RNA的不同物种的细胞，但核苷酸序列较低同源性等）。这对于校准特定探针的FISH信号以及FISH斑点分析都很有帮助。优选证实敲除细胞系不表达目的RNA。我们注意到截短的RNA可能是从敲除细胞中表达的，这些可以通过FISH检测到。
1. 预热1x PBS和培养基至37°C。
2. （可选）如果涂覆盖玻片，准备涂层溶液（例如，在1x PBS中稀释纤维连接蛋白1：100）。
3. 对于每个样品，将盖玻片放入12孔板的孔中。
4. 用1ml 70％乙醇短暂洗涤。吸出乙醇。
5. 用1ml无菌1x PBS短暂洗涤。
6. （任选）加入1ml涂层溶液并根据需要孵育（例如，对于纤连蛋白，在细胞培养箱中孵育10-20分钟）。除去涂层溶液并用1ml PBS（x1）洗涤。
7. 每孔放置1ml培养基。
8. 选择种子贴壁细胞。＆nbsp;
9. 在细胞培养箱中培养细胞所需的实验时间;不要让文化变得融洽。固定时最大约80％-90％汇合。
鱼类
一般评论：
1. 为避免RNase污染样品，戴上手套，使用屏障尖端，避免在经常使用RNase的表面上工作（例如，从质粒制备试剂盒中）。＆nbsp;
2. 为安全起见，使用PFA和甲酰胺溶液的工作应在化学（烟雾）罩中进行。
3. 除了“杂交”之外的所有步骤都在盖玻片留在孔中时进行，每孔加入1ml溶液。
4. 建议将液体吸移到井壁上而不是直接吸附到细胞上。对于具有精细结构的细胞（例如，树突，膜纳米管），建议在最慢的设置下使用移液器辅助装置，而不是使用真空吸气器。
5. 在洗涤步骤中无需摇动12孔板。
1. 用PBSM洗涤细胞（3次快速冲洗）。
2. 通过在室温（RT）下用固定缓冲液（新鲜制备）孵育10分钟（不再参见注释1）来固定细胞。
3. 用猝灭缓冲液洗涤，室温下10分钟。＆nbsp;
4. 在室温下用PBSM洗涤10分钟。重复此步骤。此时细胞可在4℃下放置过夜。
5. 通过与透化缓冲液在室温下孵育10分钟（不再参见注释1）来使细胞透化。
6. 在室温下用PBSM洗涤10分钟。重复此步骤。
7. 在室温下与Pre-hyb缓冲液孵育30分钟。
8. 在等待（步骤C7）的同时，将预制的杂交缓冲液与探针混合，并制备杂交室（参见配方和注释2）。
9. 将45μl杂交缓冲液置于杂交室中的每个预期的盖玻片位置。没有必要去除大气泡，但避免小泡沫状气泡。
10. 使用镊子，轻轻地从井中取出每个盖玻片，通过触摸Kimwipe的边缘去除多余的液体，并将盖玻片的细胞面朝下放在杂交缓冲液上（参见视频1和注释3）。
  
  视频1.将盖玻片从12孔板转移到杂交室
11. 用Parafilm密封杂交室，用铝箔包裹，并置于37℃培养箱中3小时至过夜。
12. 用Pre-hyb缓冲液制备新的（或相同的）12孔板。
13. 使用镊子将盖玻片转移回12孔板，细胞朝上。
14. 用铝箔盖住平板，在37°C培养箱中孵育15分钟。
15. 在Pre-hyb缓冲液中再次洗涤，在37℃下15分钟。＆nbsp;
16. 在室温下用2x SSC快速冲洗（3次快速冲洗）。
17. 在室温下在DAPI染色溶液中染色（预热至室温）1分钟。
18. 用2x SSC洗涤5分钟。
19. 在最后的清洗步骤中，在纸板托盘中准备显微镜载玻片：＆nbsp;
  1. 标记幻灯片。
  2. 在提起盖玻片之前，为每个盖玻片添加20μlPro-Long防褪色溶液（每个载玻片可以有两个）。去除任何气泡。另见注4。
20. 使用镊子提起盖玻片，去除多余的液体，将细胞面朝下放在Pro-Long防褪色滴上。＆nbsp;
21. 在室温下在黑暗中干燥至少几个小时（为了获得最佳图像，请等待> 24小时）。＆nbsp;
22. （可选）对于长期储存，在Pro-Long干燥后，在盖玻片边缘周围涂指甲油。＆nbsp;
23. 幻灯片可以在RT存储几天（至少，我们没有检查超过一周）。保持在-20°C长期储存（数月至数年）。＆nbsp;
成像
重要提示：同一实验的所有幻灯片都应使用相同的条件进行成像。
1. 可以在任何宽视场显微镜上进行成像，详见设备部分。
2. 不要使用共焦显微镜进行smFISH成像。激光的较高光强度会导致FISH信号的快速漂白。由于smFISH信号相对较弱并且需要较长的曝光时间来收集足够的光，因此光漂白限制了所收集的光的总量。在拍摄多个 z 部分以创建3D图像堆栈时，这尤其成问题。＆nbsp;
3. 图像应在相关通道上以降序颜色[例如，Cy5（670 nm，远红色），Cy3（570 nm，黄橙色），Alexa488（520，绿色）和DAPI（460nm，蓝色）]。这在使用DAPI成像时尤其重要，因为我们已经注意到在一些细胞类型（例如，MEF，HEK293T细胞）中，通过DAPI通道成像可能导致在其他通道中出现颗粒状自发荧光。这种情况并不常见（即，每次都不会发生）但是使用几台显微镜进行复制。
4. 曝光时间：对于FISH，建议每个FISH通道使用最大（100％）光源功率和1-3秒的曝光时间。对于DAPI，请使用低功率设置和非常短的曝光时间（例如，30％功率，20-40 ms）。
5. 对于FISH斑点检测，更多的光子（即，更长的曝光时间）意味着更好的检测，但也增加了背景荧光。因此，用户应相应地调整时间和曝光参数。
6. Z - 切片：为了检测整个细胞体积中的RNA斑点，应收集多个 z - 切片。建议使用0.2-0.3μm的步骤并收集至少30个切片（即，对于扁平细胞，如成纤维细胞）或更多（例如，用于HEK293T或N87细胞我们使用41 z -sections）。成像时，在切换到下一个通道之前，选择在一个通道中对所有 z - 部分进行成像的选项。
7. 分箱：为了获得更好的分辨率，使用像素分级1 x 1.但是，有时为了有利于信号增强而不是分辨率，可以使用2 x 2分级。
8. 有关FISH图像和 z -stacks的示例，请参见图2和视频2-5。
  
  图2.通过FISH-quant生成的未过滤和过滤的FISH图像的示例。使用针对人HER2 mRNA的Stellaris探针对人NCI-N87胃癌细胞（顶行）和永生化MEF（底行）进行smFISH。在配备有Illuminator HXP 120 V光源，PlanApo 100x 1.4 NA油浸物镜和Hamamatsu Flash 4 sCMOS相机的Zeiss AxioObserver Z1 DuoLink双相机成像系统上进行成像。对于两种细胞类型，使用电动 XYZ 扫描阶段130×100PIEZO和ZEN2软件以0.0645μm/像素拍摄41步0.2μm z - 堆叠图像。图像显示中间 z - 部分的最大投影。注意，与N87相比，MEFs FISH图像（左下）的亮度增加，以允许更好地观察细胞。有关每个图像的完整 z - 堆叠，请参阅视频2-5。比例尺=10μm。
  
  视频2.使用人类HER-Q570探针的N87细胞的3D FISH图像
  
  视频3.视频2中单元格的3D滤波图像
  
  视频4.使用人HER-Q570探针的MEF细胞的3D FISH图像
  
  视频5.视频4中的单元的3D滤波图像

数据分析

FISH斑点分析由使用3D高斯拟合算法拟合衍射限制斑点的程序执行。许多实验室都会生成自己的软件/脚本。我们建议使用FISH-quant（Mueller et al。，2013; Tsanov et al。，2016），因为它是用户友好的并且可以进行多种分析（ ie ，成熟mRNA，转录位点分析，共定位）。 FISH-quant的图像需要采用TIFF格式，作为每个通道获得的多个 z 部分的单独文件。如果显微镜不以TIFF格式保存文件，请使用其他程序（例如，FIJI）转换图像。按照FISH-quant的说明进行分析。
简述：

安装MATLAB，然后安装FISH-quant。
在FISH-quant的主界面中：
1. 选择文件夹（主文件夹，图像文件夹，轮廓文件夹，结果文件夹）。
2. 插入实验参数： XY 像素大小（基于相机和分档）， Z 像素大小，油的折射率，物镜的NA，激发和发射波长FISH探针荧光团。＆nbsp;
3. 在工具→轮廓设计器下：绘制细胞，细胞核和转录位点（TS）的轮廓（提示：分别使用基于DAPI和TS / FISH染色的自动“检测细胞核”和“TS自动检测”）。＆nbsp;
4. 上传图片轮廓。
5. 过滤背景（尝试不同的模式和参数以获得最佳过滤）。有关过滤后的图像和 z - 堆栈的示例，请参见图2和视频3和5。
6. 根据说明执行预检测。
7. 使用高斯算法拟合斑点。
8. 使用阈值参数可以获得最佳效果。
9. 保存检测设置。
从工具→批处理可以执行多个图像的分析。批量分析后可以修改阈值参数以微调结果。建议设置参数，使阴性对照接近0个点。＆nbsp;
使用工具→点检查器消除明显的误报（例如，高自发荧光区域）。＆nbsp;
来自FISH-quant的数据保存为'.txt'文件。可以将数据复制并粘贴到Excel中进行进一步分析（例如，图3）。

图3.人类N87癌细胞和MEF中人HER2 mRNA表达水平的FISH-quant分析。每个圆/三角形代表单个细胞的斑点数。

笔记

要保持的最关键的孵育时间是固定和透化步骤。对于所有其他洗涤步骤，样品可以保留更长的孵育时间。根据我们的经验，淬火/洗涤30分钟和Pre-hyb长达60分钟对FISH没有任何不利影响。较短的孵育时间（例如，5分钟）或较少的洗涤次数（例如，一次而不是固定/透化后两次）具有小的但不同的不利影响。缩短杂交后洗涤时间将导致背景信号的显着增加。该方案中的孵育时间适用于许多细胞类型（包括MEF，许多癌细胞系，小鼠原代海马神经元等）。然而，孵育时间可能需要用户优化以适合他们自己的细胞系。
使用荧光团时无需调暗灯光，但建议在添加抗褪色溶液之前尽量减少光照。在成像过程中房间应该变暗，以尽量减少自发荧光并避免背景光污染。＆nbsp;
使用镊子轻轻用力抓住并抬起盖玻片，因为盖玻片很容易折断。如果盖玻片破裂成两个大块，它仍然可以挽救，并且实验可以继续（确保将两个碎片分开，这样它们就不会将一个碎片粘在另一个上面）。此外，如果镊子没有牢牢地握住盖玻片，盖玻片可能会掉到工作台上。同样，盖玻片仍然可以挽救，但是用户需要猜测细胞的正确侧面。
还有其他商业上可获得的抗褪色溶液，以及可以使用的实验室制备的抗褪色溶液（例如，通过使用葡萄糖氧化酶）。但是，我们没有经验，这些可能不适合FISH或长期储存。

食谱

PBSM缓冲液（500毫升）
50毫升10倍PBS
2.5毫升MgCl 2 1M
475毫升无核酸酶水
在RT存储
固定缓冲液（8毫升）
7毫升PBSM
1毫升PFA 32％
准备新鲜
淬火缓冲液（10毫升）
9.5毫升PBSM
0.5毫升2 M甘氨酸
准备新鲜，因为它往往会得到微生物污染
提前准备库存解决方案：＆nbsp;
1. PBSM缓冲液（食谱1）
2. 2 M甘氨酸原液在水中，过滤灭菌（在室温下储存）
透化缓冲液（100毫升）
10毫升10倍PBS
1ml Surfact-Amps TM X-100 10％
89毫升无核酸酶水
在RT存储
预杂交（Pre-hyb）缓冲液（10 ml）
1毫升20倍SSC
1毫升甲酰胺（使用前温热至室温）
8毫升无核酸酶水
准备新鲜
杂交缓冲区＆nbsp;

向杂交缓冲液中添加新鲜探针。建议首次使用探头时校准探针浓度（默认值：250 nM或10 ng /样品）。

提前准备库存解决方案：
1）10mg / ml E.大肠杆菌 tRNA溶液在无核酸酶的水中。储存在-20°C。
2）20％硫酸葡聚糖水溶液（粘稠，需要30-60分钟才能完全溶解）。在RT存储。
杂交室
1. 塑料盒或塑料盘（例如，培养皿，15cm组织培养皿）。腔室的尺寸应适应所有盖玻片，允许盖玻片之间至少几毫米
2. 将封口膜放在室底部。避免盖玻片放置的皱纹
3. （可选）绘制网格（每个正方形应适合单个盖玻片）并标记正方形
4. 取15毫升锥形管的盖子，将其放在室的边缘。用1毫升水或缓冲液填充盖子（这需要保持腔室内的湿度）
5. 放置盖玻片后，准备一块封口膜以密封腔室
6. 准备铝箔以覆盖腔室以防止光线照射
7. 塑料腔可以多次重复使用
DAPI染色液（200毫升）
20毫升20倍SSC
10μl10mg/ ml DAPI（终浓度：0.5μg/ ml）
180毫升无核酸酶水
在4°C的黑暗中储存
提前准备DAPI股票解决方案：
10mg / ml DAPI水溶液。在-20°C的黑暗中储存

致谢

G.H.是Koshland基金会和McDonald-Leapman Grant高级博士后奖学金的获得者。这项工作的资金来自Joel和Mady Dukler癌症研究基金（WIS）的赠款，Moross综合癌症中心，Weizmann研究所和美国以色列国家科学基金会 - 国家科学基金会的原则证明（＃ 2015846）到JEG

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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