材料和试剂

10cm 2 组织培养处理的平板（Corning，目录号：CLS430165）
低蛋白结合0.45μmPDVF过滤器（Millipore，目录号：SLHV033RS）
10毫升塑料注射器无菌（任何品牌）
无菌玻璃罐
一次性塑料移液器（5毫升和10毫升）
无菌1.5毫升Eppendorf管
巴斯德吸管
HEK293T（293T）（ATCC，目录号：CRL-3216）
靶细胞系（任何人类癌细胞系）
Xtreme基因9转染试剂（Sigma-Aldrich，636577900）
包装质粒：pCMV delta R8.2（Addgene，目录号：12263）和pCMV-VSV-G（Addgene，目录号：8454）和您感兴趣的质粒（test and control plasmid - 参见注释）
10％漂白剂
Polybrene溶液：8 mg / ml水过滤灭菌（Hexadimethrine bromide，Sigma，目录号：H9268），每次都是新鲜的。
Opti-MEM减少血清培养基（Thermo Fisher，目录号：31985062）
DMEM完全培养基，含10％FBS和笔链
选择抗生素（例如，嘌呤霉素）
干冰或液氮
DMSO
液氮

设备

细胞培养箱（37°C，5％CO 2 和32°C，5％CO 2 ）
血细胞计数器（标准）
层流罩BSL-2型
37°C水浴
高压灭菌器
微量移液管（1000μl，200μl）
-80°C冰柜

程序

HEK293T细胞中慢病毒的制备
1. 第0天：在10cm 2 平板中接种约2-3百万个HEK293T细胞。
2. 第1天： HEK293T细胞应该约70-80％融合。如果由于某种原因他们似乎少了你可能会等待另一个
  8-10小时。＆nbsp;
3. 按照制造商的说明，使用以下比例在无菌1.5 ml Eppendorf管中制备转染混合物：
  class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：500px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Opti-MEM媒体
  1毫升
  pCMV delta R8.2
  2微克
  pCMV-VSV-G
  0.5μg
  靶质粒
  1.5μg
  Xtreme基因9
  12μl（1：3，DNA：Xtreme Gene，Ratio）将所有五种成分加入1.5 ml Eppendorf管中后，通过移液或倒置混合溶液。不要涡旋。在室温下孵育混合物约20分钟。
4. 使用巴斯德吸管从HEK293T细胞中吸出培养基，并加入约9ml新鲜的完全DMEM培养基。
5. 将转染混合物温育20分钟后，使用200μl微量移液管将混合物加入HEK293T中。确保逐滴添加混合物以覆盖板的整个区域。＆nbsp;
6. 将板在37℃细胞培养箱中孵育约48小时。
7. 第3天：使用10 ml一次性无菌移液管，从无菌15 ml管中的HEK293T平板上收集上清液/培养基。将另一种新鲜的10ml DMEM培养基加入培养板中，然后将其移回培养箱。将收集的上清液转移到10ml注射器中，然后通过层流罩内的0.45μmPVDF过滤器过滤。该步骤将导致收集过滤的病毒上清液，其中没有任何残留的HEK293T细胞。
  注意：为确保正确处理与病毒接触的所有设备，此处使用的所有移液器，吸头，注射器和过滤器必须用10％漂白剂清洗约10分钟，然后再将其丢弃。生物危害垃圾箱。＆nbsp;
8. 如果您没有准备好目标细胞或者您打算稍后使用慢病毒，您可以使用干冰或液氮快速冷冻病毒上清液，然后将其储存在-80°C。在这个温度下，病毒通常可以稳定几个月。
9. 第4天：如果需要，可以从仍然生长的HEK293T细胞板收集另一轮10 ml慢病毒上清液，类似于第3天。在丢弃生物危害箱中的HEK293T细胞板之前，应该对它们进行处理用10％漂白剂约5-10分钟。＆nbsp;
Pro-tip：高病毒滴度的概率可以从HEK293T细胞死亡的数量来估计，即细胞死亡越多，收集高滴度病毒的概率就越大。＆nbsp;
靶细胞的制备
1. 第2天（如果你想与病毒制剂同时进行，推荐）：种子约0.5-1 x 10 6 靶细胞每个在两个10cm 2 组织培养板中。一个平板是你将添加病毒上清液的地方，即，慢病毒和另一个将是你的杀戮控制，你不会添加任何慢病毒。
2. 第3天：在转导之前，靶细胞应该是约40％-50％汇合，即，添加病毒。如果您的慢病毒在冰箱中，请确保在37°C水浴中解冻，然后再将其加入细胞。一旦细胞准备好，准备聚凝胺培养基（靶细胞培养基）混合物。聚凝胺的最终浓度应为8μg/ ml。通过添加2ml含有20μl8mg/ ml Polybrene的培养基制备10x聚凝胺培养基混合物。使用巴斯德吸管吸取目标细胞中的培养基，加入1 ml聚凝胺培养基混合物，孵育约1-2分钟。
  注意：建议每次将聚凝胺溶液制成新鲜的，或者将其等分试样保存在-20°C。每次解冻并使用等分试样。不要重新冻结。＆nbsp;
3. 使用一次性10 ml移液器，向靶细胞中加入9 ml慢病毒。在杀灭控制板上加入普通培养基。
4. 第4天：重复与第3天相同的步骤，进行第二轮转导以确保所有细胞都获得慢病毒。请参阅步骤A7中的注释。＆nbsp;
5. 第5天：将选择的抗生素以杀灭浓度（例如，嘌呤霉素1-2μg/ ml）加入两个平板中。参见注释以确定选择抗生素的杀灭浓度。通常，每两天添加含有抗生素的新鲜培养基，直到杀死对照板中的所有细胞都死亡。
6. 第8-10天：在进行任何进一步的实验之前，确保在液氮中用DMEM冷冻约10％DMSO中的1/4部分细胞。传代其余细胞进行RNA /蛋白质分离，以验证目的蛋白质的稳定表达。

笔记

杀灭曲线的产生：在使用任何细胞系中的选择制造者使用慢病毒生成稳定细胞之前，生成杀死曲线总是一个好主意。快速谷歌搜索会告诉你使用抗生素浓度的大致范围。通常，测试至少3-4种不同浓度以确保完全杀死。例如，对于嘌呤霉素，将以1μg/ ml，2μg/ ml，3μg/ ml和4μg/ ml测试以下浓度48-72小时。＆nbsp;
测试和控制质粒：应与测试质粒一起使用合适的对照质粒。例如，如果进行基于shRNA的敲除，那么你应该包括具有非靶向序列而不是shRNA的shControl质粒，或者如果你基于ORF的过表达，那么空载体应该用作对照。

致谢

这项工作得到NIH Grants CA-67166，CA-198291和CA-197713，悉尼弗兰克基金会和Kimmelman基金（AJG）的支持。

利益争夺

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

LaGory，E.L.，Wu，C.，Taniguchi，C.M.，Ding，C.K.，Chi，J.T。，von Eyben，R.，Scott，D.A.，Richardson，A.D。和Giaccia，A.J。（2015）。抑制PGC-1α对肾细胞癌中氧化代谢的重编程至关重要。 em> Cell Rep 12：116-127。